Данная методика сочетает в себе усовершенствование протокола клиринга с возможностью оптического сечения глаз по технологии Mesos PIM, что позволяет выполнять мезоскопические реконструкции с микрометрическим разрешением. Это дает возможность визуализировать массивные сердечные ткани или целый раствор сердца мыши за одно сканирование без потери исходной трехмерной организации тканей. После того, как сердце было каннулировано проксимальной аортой, промытой в растворе тиро и зафиксированной в 4% параформном альдегиде в 0,01 молярном PBS, оно готово к запуску протокола очистки.
Промывайте сердце три раза по 0,01 молярной PBS при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. После этого шага сердце может храниться в PBS и 0,01% азиде натрия при четырех градусах Цельсия в течение нескольких месяцев. Инкубируют сердце в 20 миллилитрах раствора гидрогеля в трясущемся состоянии при 15 об/мин в течение трех дней при четырех градусах Цельсия.
Обезвреживание образца при комнатной температуре с помощью сушилки, вакуумного насоса и трубчатой системы, которая соединяет сушилку как с лентой насоса, так и с азотным трубопроводом. Поместите образец в сушилку и откройте флакон, держа на нем колпачок. Закройте сушилку и извлеките кислород из трубки, открыв азотный трубопровод.
Включите вакуумный насос, чтобы удалить кислород из сушилки на 10 минут. Выключите насос и откройте ручку сушилки к азотному трубопроводу. Затем откройте азотный кран.
Как только давление сравняется с атмосферным давлением, осторожно откройте сушилку и быстро закройте флакон. Держите сердце в дегазированном гидрогелевом растворе при 37 градусах Цельсия в течение примерно трех часов в состоянии покоя. Когда гидрогель правильно полимеризуется и окажется полностью желатиновым, аккуратно извлеките из него сердце и поместите в очищающий раствор во флакон с очищающим раствором.
Меняйте очищающий раствор во флаконе один раз в три дня, чтобы ускорить процедуру осветления. Как только сердце появится полностью очищенным, извлеките его из флакона и промойте в 50 миллилитрах разогретого PBS в течение 24 часов в трясущемся состоянии. Снова мойте в 50 миллилитрах одного X PBS T в течение 24 часов в трясущемся состоянии.
Инкубируют образец в 0,01 миллиграмма на миллилитр зародышей пшеницы аглютинина Alexa floor 633 в трех миллилитрах одного X PBS T в состоянии встряхивания при 50 об/мин при комнатной температуре в течение семи дней. После семидневной инкубации промыть образец в 50 миллилитрах одного X PBS T при комнатной температуре в тряске в течение 24 часов. Инкубируйте образец в 4% PFA в течение 15 минут, а затем промывайте его три раза в 0,01 молярной PBS в течение пяти минут каждый.
Инкубируют сердце последовательно в 20 и 47% TDE в 0,01 молярной PBS в течение восьми часов каждый. И затем, наконец, при 68% TDE в 0,01 молярной PBS обеспечить требуемый показатель преломления 1,46. Аккуратно заполните около 80% наружного кварцевого кварцевого кувета средой с показателем преломления.
Наполните внутренний кварцевый квет той же средой с показателем преломления. Погрузите образец внутрь внутреннего квета. Осторожно переместите образец на дно квета с помощью тонкого пинцета и расположите сердце с его продольной осью параллельно главной оси кувета, чтобы свести к минимуму световой путь возбуждения через ткань во время сканирования.
Аккуратно закрепите специальную заглушку над внутренним кветом двумя винтами. Установите образец на ступень микроскопа с помощью магнитов. Переведите вертикальный этап образца вручную, чтобы погрузить внутренний квет во внешний.
Включите источник света возбуждения с длиной волны 638 нанометров и установите его на низкую мощность порядка трех милливатт. Переместите образец с помощью моторизованного транслятора, чтобы осветить внутреннюю пластину ткани. Включите программное обеспечение камеры с изображением HC и установите триггер камеры на внешний крайний триггер светового листа, чтобы управлять триггером захвата камеры пользовательским программным обеспечением, управляющим всей настройкой.
Включите автоматическое сохранение в программном обеспечении камеры и установите выходную папку, в которой необходимо сохранить изображения. Вручную отрегулируйте положение образца в плоскости X Y с помощью линейных трансляторов, чтобы переместить образец в центр поля зрения датчика камеры. Переместите образец вдоль оси Z с помощью линейного моторизованного транслятора для определения границ сердца для томографической реконструкции.
Увеличьте мощность лазера примерно до 20 милливатт перед началом сеанса визуализации. Начните томографическую съемку, нажав кнопку «Пуск» на панели захвата программного обеспечения для визуализации, и в то же время начните перемещать образец по оси Z с постоянной скоростью шесть микрометров в секунду с помощью моторизованного транслятора. Сочетание методологии четкости с ТДЭ в качестве среды показателя преломления существенно не изменяет конечный объем образца и не приводит к изотропной деформации образца.
Оптика возбуждения производила световой лист с минимальными отходами около шести микрометров, которые расходились до 175 микрометров на краю поля зрения. Синхронизация скользящего затвора камеры с осевым сканированием отходов светового листа обеспечила сбор эмиссионного сигнала только в части образца, возбуждаемой отходами светового листа, в результате чего средний F W H M составляет около 6,7 микрометров по всему полю зрения. Функция распространения точки Z микроскопа также была оценена томографической реконструкцией флуоресцентной наносферы, а F W H M 6,4 микрометра был оценен по подгонке.
Также была подтверждена способность системы разрешать одиночные клеточные мембраны в трех измерениях с достаточным соотношением сигнал/шум во всем органе. Процедура дегазации является наиболее важным этапом протокола. При неправильном выполнении ткани могут возникнуть повреждения, указывающие во время инкубации в чистящем растворе.
Представленный протокол может быть объединен с протоколом мульти окрашивания для достижения реконструкции целого органа, интегрирующего различные биологические структуры, и может быть применен для изучения патологических моделей.
