Этот протокол позволяет исследователям определить, происходит ли активность каспазы в сочетании с гибелью клеток, тем самым идентифицируя различные способы гибели клеток. Преимуществом этого метода является гибкость для оценки активности каспазы в популяционном анализе или одной клетке. Продемонстрировать процедуру будут Стефани Руфли, аспирант, и Цзин Тонг, приглашенный аспирант из лаборатории Венди Вей-Линн Вонг.
После дифференцировки и сбора макрофагов или BMDM, полученных из костного мозга, как описано в рукописи, посейте их в шестилуночную пластину с плотностью от одного раза 10 до шестого количества клеток на миллилитр. Обрабатывайте клетки миметиком SMAC в течение 16 часов. Чтобы приготовить лизат клеток, перенесите пластину, содержащую обработанные клетки, на лед и соберите питательную среду клеток в 1,5-миллилитровую трубку.
Центрифуга при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте среду и положите трубку на лед. Затем добавьте один миллилитр холодного PBS в пластину для культивирования клеток, чтобы промыть клетки.
После аспирации всех PBS добавьте в клетки 100 микролитров трипсина. Как только клетки отсоединятся от пластины, соберите их в 1,5-миллилитровую трубку. После центрифугирования клеточной суспензии удаляют надосадочный агент и повторно суспендируют гранулу в буфере лизиса DISC объемом 100 микролитров.
Инкубируйте образец на льду в течение 20 минут, а затем центрифугируйте лизат, чтобы гранулировать нерастворимую фракцию. Перенесите 25 микролитров лизата на белую плоскодонную 96-луночную пластину для анализа активности каспазы-3/7 и 10 микролитров на прозрачную плоскодонную 96-луночную пластину для анализа бицинхониновой кислоты или BCA. Для количественной оценки белка подготовьте ряд концентраций бычьего сывороточного альбумина или BSA в качестве стандартного белка.
После добавления стандартного BSA к плоскодонной 96-луночной пластине, содержащей образцы, смешайте реагенты BCA один и два в соотношении 50 к одному и добавьте 200 микролитров к каждому образцу в стандарте. После инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут измерьте поглощение на 562 нанометрах на флуорометрическом приборе и количественно оцените концентрацию белка с помощью стандартной кривой. Чтобы выполнить популяционный анализ, запустите флуорометрический инструмент и нагрейте машину до 30 градусов по Цельсию.
Установите длину волны возбуждения и излучения на 360 и 465 нанометров соответственно. Затем приготовьте мастер-реакционную смесь на льду, как описано в рукописи, чтобы определить активность каспазы. Добавьте 75 микролитров смеси к каждому образцу и стандарту, чтобы получить общий реакционный объем 100 микролитров.
Немедленно измерьте флуоресценцию с помощью флуорометрического прибора и записывайте отдельные показания каждую минуту в течение 40 минут, чтобы определить кинетику реакции. После посева соберите адгезивные ячейки, как было продемонстрировано ранее, в пятимиллилитровую полистирольную трубку. Затем центрифугируйте образец при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите супернатант.
Для приготовления окрашивающей смеси берут один микролитр фторогенного субстрата и разбавляют его 150 микролитрами PBS. Добавьте 50 микролитров окрашивающей смеси на образец, высиживайте ее в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут и перемешивайте каждые 15 минут. В этом популяционном анализе репрезентативные данные кинетического анализа активности каспазы-3/7 показали увеличение расщепления субстрата с увеличением миметической концентрации SMAC.
Однако увеличение на 500 наномолярной концентрации было незначительным на основе обычной односторонней ANOVA с множественными сравнениями. Анализ активности каспазы-3/7 с использованием проточной цитометрии показал сдвиг флуоресценции для клеток, обработанных миметиками SMAC, по сравнению с необработанными клетками, что также было очевидно в построенной средней интенсивности флуоресценции и увеличение при 500 наномолярной концентрации было значительным. Процедура должна проводиться на льду.
Однако в популяционном анализе образцы нельзя оставлять на льду бесконечно. После стадии лизиса образцы должны быть дополнительно обработаны или немедленно заморожены. Визуализация активности каспазы с использованием микроскопии живых клеток будет дополнительным методом получения кинетической информации на уровне одной клетки.
