Этот протокол обеспечивает многогранное понимание активации процессов гибели клеток, что может дать критическое представление о механизмах заболевания и информировать терапевтические стратегии. Этот протокол основан на использовании более простой техники и для доступа к активации нескольких каспаз, императивно из одной популяции эндогенных клеток, чтобы в значительной степени определить активацию. Гибель врожденных иммунных клеток связана со всем спектром заболеваний, от инфекций до воспалительных заболеваний и рака.
Понимание молекулярных механизмов гибели клеток через активацию каспазы может дать критическое представление о процессах заболевания. Доктор Джулианн, научный сотрудник лаборатории, продемонстрирует процедуру. После выделения костного мозга и дифференцировки BMDM заражают клетки вирусом гриппа А.
Рассчитайте объем вируса, необходимый при кратности заражения 20 бляшеобразующих единиц. Удалите среду из BMDM и промойте клетки один раз 500 микролитрами PBS. Добавьте 450 микролитров вируса гриппа А в DMEM с высоким содержанием глюкозы без инактивированного тепла FBS в каждую лунку и инкубируйте планшеты при 37 градусах Цельсия в течение одного часа в увлажненном инкубаторе, чтобы обеспечить всасывание.
В конце часовой инкубации добавьте 50 микролитров инактивированного теплом FBS и верните планшеты в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия в общей сложности на 12 часов. Через 12 часов инкубации выньте пластину из инкубатора. Аспирируйте 150 микролитров надосадочной жидкости и выбросьте или сохраните ее для надосадочного анализа.
Не удаляйте остатки надосадочной жидкости. Теперь создайте раствор для сбора белка, объединив 50 микролитров буфера для лизиса каспазы и 100 микролитров четырех буферов XSDS на лунку. Затем добавьте по 150 микролитров смеси в каждую лунку.
Для каждой лунки пипеткой вбейте смесь, чтобы собрать лизированные клетки и надосадочную жидкость. Во время пипетки соскребите дно лунки наконечником пипетки, чтобы разрушить клетки. После соскабливания и пипетки соберите лизат белка в меченые пробирки объемом 1,5 миллилитра.
С помощью теплового блока нагрейте все трубки до 100 градусов Цельсия в течение 12 минут. Снимите пробирки с теплового блока и центрифугу при 14, 500 G в течение 30 секунд при комнатной температуре, чтобы гранулировать любые нерастворимые компоненты. Приготовьте аппарат для электрофореза с 12%-ным полиакриламидным гелем с 10 лунками.
Наполните аппарат для электрофореза проточным буфером и снимите гелевую расческу. Затем нагрейте образцы до 100 градусов Цельсия в течение пяти минут. Центрифугируют образцы при 14 500 G в течение 30 секунд при комнатной температуре перед загрузкой.
Затем медленно загрузите 30 микролитров образца в каждую лунку. Используют комбинированный надосадочную жидкость и буфер лизата белка и лизиса каспазы или тканевый гомогенат для каспаз 1, 3, 7 и 8 и используют белковый лизат DN RIPA буфер, описанный в протоколе, или тканевый гомогенат для каспаз 11 и 9. Чтобы оценить все шесть каспаз одновременно, используйте одну и ту же процедуру для загрузки одних и тех же образцов в каждый из шести гелей.
Подключите аппарат для электрофореза к источнику питания и установите мощность 80 вольт на 20 минут, чтобы начать запуск геля. По истечении первых 20 минут отрегулируйте питание до 100 вольт в течение 45–60 минут. Обратите внимание на переднюю часть красителя.
Как только передняя часть красителя достигнет нижней части геля, выключите питание. Пока гель течет, подготовьте буфер переноса, как описано в рукописи. Каждый раз делайте раствор свежим.
Удалите гель из аппарата для электрофореза с помощью гель-релизера. Чтобы настроить стек переноса для геля, активируйте мембрану PVDF, замочив ее в метаноле на одну минуту. Предварительно смочите два куска фильтровальной бумаги, гель и мембрану PVDF и перенесите буфер на пять минут.
Храните мембрану PVDF и гель в отдельных контейнерах во время этой пятиминутной инкубации. Приступайте к сборке передаточного стека на полусухой системе. На нижнюю платиновую наносторону поместите один кусок фильтровальной бумаги, мембрану PVDF, гель и, наконец, один кусок фильтровальной бумаги.
Аккуратно раскатайте или выдавите пузырьки воздуха между слоями и закройте верхнюю часть системы. Теперь подключитесь к источнику питания. Установите питание на 25 вольт в течение 40 минут.
После переноса разберите стек переноса, соберите мембрану и поместите ее в квадратную чашку Петри. Затем выполните блокировку мембраны, добавив 15 миллилитров 5%-ного раствора обезжиренного молока, и инкубируйте мембрану на шейкере-качалке при 50-70 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации удалите блокирующий раствор, добавьте 10 миллилитров разбавленного раствора антител и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре или четырех градусах Цельсия в течение ночи на шейкере-качалке, как показано ранее.
Затем соберите раствор антител и промойте мембрану, добавив 15 миллилитров TBST к мембране на качающемся шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут. Откажитесь от TBST. Повторите стирку с 15 миллилитрами TBST три раза.
Добавьте 10 миллилитров разбавленного вторичного раствора конъюгированных антител HRP. Инкубировать на шейкере-качалке при комнатной температуре в течение одного часа. В конце инкубации, как только раствор антител будет удален, промойте мембрану, добавив 15 миллилитров TBST на качающемся шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут.
После завершения этапов промывки и удаления TBST добавьте 10 миллилитров высокочувствительного субстрата HRP. Дайте ему постоять при комнатной температуре одну минуту. Снимите мембрану с субстрата.
Приступайте непосредственно к визуализации с помощью хемилюминесцентного тепловизора с дополнительным белым транс-лотком, вставленным в нижнее положение. Экспонируйте мембрану, используя режим автоматической экспозиции. Проанализированы про- и активированная каспаза 1, 11, 3, 7, 8 и 9 в диком типе и мутант ZBP1 после вирусной инфекции гриппа А, дикий тип и мутант AIM2 после инфекции HSV1 и инфекция Francisella novicida или BDM дикого типа и мутант NLRP3 после липополисахарида и стимуляции АТФ.
Клетки, в которых отсутствуют восходящие датчики PANoptosis, не подвергаются устойчивой клеточной гибели в ответ на родственные стимулы, индуцирующие PANoptosis. Инфекция, вызванная вирусом гриппа А, индуцирует образование ZBP1-PANoptosome, а клетки с дефицитом ZBP1 значительно защищены от гибели клеток во время вирусной инфекции гриппа А. Точно так же инфекции HSV1 и Francisella novicida индуцируют образование паноптосомы AIM2, а клетки с дефицитом AIM2 не могут подвергаться устойчивой гибели клеток в ответ на эти инфекции.
Клетки, в которых отсутствуют восходящие датчики воспаления, защищены от гибели клеток в ответ на соответствующие стимулы, а клетки с дефицитом NLRP3 не подвергаются клеточной гибели в ответ на липополисахарид и АТФ. Важно не забыть приготовить смесь обоих клеточных лизата для определения конкретной каспазы. После загрузки струи светящийся образец следует хранить при температуре минус 20 градусов, чтобы сохранить целостность целей каспазы для последующего наблюдения. В сочетании с этим протоколом визуализация клеточной смерти в реальном времени или анализы LDH могут использоваться для мониторинга выполнения клеточной гибели, а ELIZA могут использоваться для проверки высвобождения цитокинов или DAMP из клеток, подвергающихся различным типам клеточной гибели.
