Этот метод количественно оценивает пространственно-временную динамику поляризованных клеток вдоль их срединной линии, экспрессирующей флуоресцентный репортер или краситель для конкретного интересующего объекта, такого как актин, ионы или динамика везикул. Версия автоматизации устраняет предвзятость и обеспечивает масштабируемость, особенно для задач, которые выполняются вручную в цифровом виде и могут стать трудоемкими и субъективными. Для начала откройте Jupyter Notebook и прочтите файлы интервальной съемки, перейдя на домашнюю страницу интерактивной записной книжки Google CoLab или загрузив и открыв AMEBaS_local IP YNB с GitHub.
Чтобы подготовить настройку каталога для входных и выходных данных с использованием локальной версии, поместите таймлапс флуоресценции в виде файла TIF или DV в папку с именем data, расположенную в корневой папке программы. Создайте исходящую папку для получения сгенерированных данных, а затем запустите блок кода установки. Если вы используете блокнот в Google CoLab, выполните блок кода настройки для автоматического создания данных и исходящих папок, затем запустите блок кода ввода файла для чтения данных интервальной съемки, нажав кнопку воспроизведения.
Если вы используете Google CoLab, загрузите файл интервальной съемки в папку данных, нажав кнопку выбора файла. Затем выберите создание дополнительных выходных данных для каждого шага, задав для параметра verbose значение true или false. Чтобы отличить основную ячейку и сегмент от фона, запустите блок кода сегментации одной ячейки, нажав кнопку воспроизведения, чтобы автоматически отделить интересующую ячейку от фона.
Отрегулируйте значение sigma в переменной sigma, чтобы точно настроить сглаживание маски сегментации. Значение по умолчанию — 2.0. Теперь установите переменную estimate в false, чтобы сохранить порог, оцененный непосредственно из данных ISO, или true для сглаживания по соседним кадрам с помощью локальной полиномиальной регрессии.
Отрегулируйте переменную n_points для точной настройки функции со значением по умолчанию 40. Чтобы трассировать срединную линию вдоль расширения ячейки, запустите блок кода трассировки средней линии ячейки, нажав кнопку воспроизведения, чтобы скелетизировать ячейку по методу Ли и удлинить кончик последнего скелета с помощью линейной экстраполяции. Затем выберите параметр трассировки для средней линии, настроив аргумент complete_skeletonization для трассировки либо по последнему кадру, либо один раз за кадр.
Настройте переменную interpolation_fraction, чтобы задать долю точек в скелете для интерполяции во время экстраполяции. Значение по умолчанию здесь равно 0,25. Затем измените переменную extrapolation_length, чтобы определить длину экстраполяции средней линии.
Значение по умолчанию равно минус единице, что удлиняет скелет до ближайшего ребра. Теперь запустите первый блок кода визуализации данных, нажав кнопку воспроизведения, чтобы автоматически создать кимограммы для обоих каналов. Выберите размер гауссова ядра для сглаживания, настроив переменную kymograph_kernel.
Для правильного отображения интенсивностей непротяженных скелетов необходима пользовательская цветовая карта для их кимографов с шапками. Настройте переменную shift_fraction, чтобы выбрать долю процента интенсивности, которая будет обозначена в качестве цвета фона (черный). Затем запустите второй блок кода визуализации данных, нажав кнопку воспроизведения, чтобы автоматически сгенерировать кимограф метрики соотношения и интервальную съемку.
Настройте переменную switch_ratio, чтобы изменить порядок каналов, используемых в качестве числителя и знаменателя во время вычисления соотношения, по умолчанию — false. Проверьте, требуется ли дополнительное сглаживание коэффициента с помощью медианного фильтра, настроив переменную smooth_ratio. По умолчанию установлено значение false.
Затем выберите удаление или сохранение выбросов, возникающих в результате низкого сигнала в канале знаменателя, настроив переменную reject_outliers. Выбросы помечаются как значения, в 1,5 раза превышающие межквартильный размах выше третьего квартиля. Наконец, выберите, нужно ли экспортировать выходные данные фона и метрики соотношения, настроив переменную background_ratio.
Значение по умолчанию — false, чтобы заменить фон нулями. AMEBaS, протестированный на наборах данных, таких как пыльцевые трубки, экспрессирующие кальций-репортер камелеон, пыльцевые трубки, экспрессирующие индикатор рН флорин, корневые волоски, экспрессирующие кальциевый репортер NESYC 3.6, успешно работал, несмотря на различия в направлении роста, методах визуализации, флуоресцентных репортерах и типах клеток. Не забудьте выполнить набор блоков, чтобы вы могли установить необходимые пакеты.
Кроме того, очень важно настроить сигма-значения специально для ваших изображений, чтобы вы могли получить более точные результаты. Полученные кимограммы затем могут быть использованы для анализа пространственно-временной динамики решаемого вопроса. Кроме того, вы можете рассчитать его, найдя метод, рост и временные ряды, чтобы проанализировать правильное решение.
