Bu yöntem, aktin, iyonlar veya vezikül dinamikleri gibi belirli bir varlık için floresan raportör veya boya eksprese eden orta hattı boyunca polarize hücrelerin uzay-zamansal dinamiklerini ölçer. Otomasyon sürümü, özellikle dijital olarak manuel olarak yapılan ve zaman alıcı ve öznel hale gelebilen görevler için önyargıları ortadan kaldırır ve ölçeklenebilirliğe izin verir. Başlamak için Jupyter Notebook'u açın ve Google CoLab etkileşimli not defteri ana sayfasına erişerek veya GitHub'dan AMEBaS_local IP YNB'yi indirip açarak hızlandırılmış dosyaları okuyun.
Yerel sürümü kullanarak giriş ve çıkış verileri için dizin kurulumunu hazırlamak için, floresan hızlandırılmış çekimi bir TIF veya DV dosyası olarak programın kök klasöründe bulunan data adlı bir klasörün içine yerleştirin. Oluşturulan verileri almak için bir çıkış klasörü oluşturun, ardından kurulum kodu bloğunu çalıştırın. Not defterini Google CoLab'de kullanıyorsanız, otomatik olarak veri ve çıkış klasörleri oluşturmak için kurulum kodu bloğunu yürütün, ardından oynat düğmesine tıklayarak hızlandırılmış verileri okumak için dosya giriş kodu bloğunu çalıştırın.
Google CoLab kullanıyorsanız, dosya seç düğmesini tıklayarak hızlandırılmış dosyayı veri klasörüne yükleyin. Ardından, ayrıntılı parametreyi true veya false olarak ayarlayarak her adım için ek çıkışlar oluşturmayı seçin. Ana hücreyi ve segmenti arka plandan algılamak için, ilgilenilen hücreyi arka plandan otomatik olarak ayırmak için oynat düğmesine tıklayarak tek hücre segmentasyon kod bloğunu çalıştırın.
Segmentasyon maskesinin düzgünlüğüne ince ayar yapmak için sigma değişkenindeki sigma değerini ayarlayın. Varsayılan değer 2.0'dır. Şimdi, doğrudan ISO verilerinden tahmin edilen eşiği depolamak için estimate değişkenini false olarak veya yerel polinom regresyonunu kullanarak komşu çerçeveler arasında yumuşatmak için true olarak ayarlayın.
Varsayılan değer 40 olacak şekilde işleve ince ayar yapmak için n_points değişkenini ayarlayın. Hücre uzantısı boyunca orta çizgiyi izlemek için, Lee'nin yöntemini kullanarak hücreyi iskeletleştirmek ve son iskeletin ucunu doğrusal ekstrapolasyon yoluyla uzatmak için oynat düğmesine tıklayarak hücre orta çizgisi izleme kod bloğunu çalıştırın. Ardından, complete_skeletonization bağımsız değişkenini son karede veya kare başına bir kez izlenecek şekilde ayarlayarak orta çizgi için izleme seçeneğini belirleyin.
Ekstrapolasyon sırasında enterpolasyon için iskeletteki noktaların fraksiyonunu ayarlamak için interpolation_fraction değişkenini ayarlayın. Buradaki varsayılan değer 0,25'tir. Ardından, orta hat ekstrapolasyonunun uzunluğunu belirlemek için extrapolation_length değişkenini değiştirin.
Varsayılan değer, iskeleti en yakın kenara kadar uzatan eksi birdir. Şimdi her iki kanal için de otomatik olarak kymograf oluşturmak üzere oynat düğmesine tıklayarak ilk veri görselleştirme kod bloğunu çalıştırın. kymograph_kernel değişkenini ayarlayarak yumuşatma için Gauss çekirdek boyutunu seçin.
Uzatılmamış iskeletlerin yoğunluklarını düzgün bir şekilde görüntülemek için, kapaklı kymografları için özel bir renk haritası gereklidir. Arka plan rengi olarak belirlenecek yoğunlukların kesir yüzdesini (siyah) seçmek için shift_fraction değişkenini ayarlayın. Ardından, otomatik olarak bir oran metriği, kymograf ve hızlandırılmış çekim oluşturmak için oynat düğmesine tıklayarak ikinci veri görselleştirme kod bloğunu çalıştırın.
Oran hesaplamaları sırasında pay ve payda olarak kullanılan kanalların sırasını değiştirmek için switch_ratio değişkenini varsayılan değer false olacak şekilde ayarlayın. smooth_ratio değişkenini ayarlayarak oran zaman atlamasının medyan filtre geçişiyle ek yumuşatma gerektirip gerektirmediğini kontrol edin. Varsayılan olarak, bu false olarak ayarlanmıştır.
Ardından, reject_outliers değişkenini ayarlayarak payda kanalındaki düşük sinyalden kaynaklanan aykırı değerleri kaldırmayı veya tutmayı seçin. Aykırı değerler, üçüncü çeyreğin üzerindeki çeyrekler arası aralığın 1,5 katı değerler olarak işaretlenir. Son olarak, değişken background_ratio ayarlayarak arka planın ve oran metrik çıktısının dışa aktarılması gerekip gerekmediğini seçin.
Arka planı sıfırlarla değiştirmek için varsayılan değer false değeridir. AMEBaS, kalsiyum raportörü kameleonunu ifade eden polen tüpleri, pH indikatörü florini ifade eden polen tüpleri, kalsiyum raportörü NESYC 3.6'yı ifade eden kök kılları gibi veri kümeleri üzerinde test edildi, büyüme yönündeki farklılıklara rağmen başarılı bir şekilde çalıştı, görüntüleme teknikleri, floresan raportörler ve hücre tipleri. Gerekli paketleri kurabilmeniz için blok kümesini çalıştırmayı unutmayın.
Ek olarak, daha doğru sonuçlar alabilmeniz için sigma değerlerini resimleriniz için özel olarak ayarlamanız çok önemlidir. Elde edilen kimografiler daha sonra ilgilenilen çözümün uzay-zamansal dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir. Ek olarak, doğru çözümü analiz etmek için bulma yöntemini, büyümeyi ve zaman serisini hesaplayabilirsiniz.
