この方法では、アクチン、イオン、小胞の動態など、特定の目的物質の蛍光レポーターまたは色素を発現する正中線に沿った分極細胞の時空間動態を定量化します。自動化のバージョンは、特にデジタルで手作業で行われ、時間がかかり主観的になりがちなタスクに対して、バイアスを排除し、スケーラビリティを可能にします。まず、Jupyter Notebook を開き、Google CoLab インタラクティブ ノートブックのホームページにアクセスするか、GitHub から AMEBaS_local IP YNB をダウンロードして開き、タイムラプス ファイルを読み取ります。
ローカルバージョンを使用して入力データと出力データのディレクトリ設定を準備するには、プログラムのルートフォルダーにあるdataという名前のフォルダー内に、蛍光タイムラプスをTIFまたはDVファイルとして配置します。生成されたデータを受け取る out フォルダーを作成し、セットアップ コード ブロックを実行します。Google CoLabでノートブックを使用している場合は、セットアップコードブロックを実行してデータとフォルダーを自動生成し、ファイル入力コードブロックを実行して再生ボタンをクリックしてタイムラプスデータを読み取ります。
Google CoLabを利用している場合は、ファイルの選択ボタンをクリックして、タイムラプスファイルをデータフォルダにアップロードします。次に、verbose パラメーターを true または false に設定して、各ステップに対して追加の出力を生成することを選択します。メイン セルとセグメントを背景から検出するには、再生ボタンをクリックして単一セル セグメンテーション コード ブロックを実行し、対象のセルを背景から自動的に分離します。
sigma 変数のシグマ値を調整して、セグメンテーションマスクの滑らかさを微調整します。デフォルト値は 2.0 です。次に、変数 estimate を false に設定して ISO データから直接推定したしきい値を格納するか、ローカル多項式回帰を使用して隣接するフレーム間でしきい値を平滑化する場合は true に設定します。
変数 n_points を調整して、既定値を 40 にして関数を微調整します。セルの延長に沿って正中線をトレースするには、再生ボタンをクリックしてセルの中間線トレース コード ブロックを実行し、Lee の方法を使用してセルをスケルトン化し、線形外挿によって最後のスケルトンの先端を延長します。次に、complete_skeletonization 引数を調整して、最後のフレームでトレースするか、フレームごとに 1 回トレースするかを調整して、正中線のトレース オプションを選択します。
interpolation_fraction変数を調整して、外挿中に補間するスケルトン内のポイントの割合を設定します。ここでのデフォルト値は 0.25 です。次に、変数 extrapolation_length を変更して、正中線外挿の長さを決定します。
既定値はマイナス 1 で、スケルトンが最も近いエッジまで拡張されます。次に、再生ボタンをクリックして最初のデータ視覚化コードブロックを実行し、両方のチャネルのキモグラフを自動的に生成します。変数 kymograph_kernel を調整して、平滑化のガウス カーネル サイズを選択します。
非拡張スケルトンの強度を適切に表示するには、キャップ付きキモグラフにカスタムカラーマップが必要です。shift_fraction変数を調整して、背景色として指定される強度の割合 (黒) を選択します。次に、再生ボタンをクリックして 2 番目のデータ視覚化コード ブロックを実行し、比率メトリック、キモグラフ、タイムラプスを自動的に生成します。
switch_ratio変数を調整して、比率計算時に分子と分母として使用されるチャネルの順序を変更します (既定値は false)。比率のタイムラプスに、smooth_ratio変数を調整して、メディアンフィルターパスで追加の平滑化が必要かどうかを確認します。デフォルトでは、これは false に設定されています。
次に、reject_outliers変数を調整して、分母チャネルの低信号に起因する外れ値を削除するか保持するかを選択します。外れ値は、第 3 四分位数より上の四分位範囲の 1.5 倍の値としてマークされます。最後に、変数background_ratioを調整して、背景と比率メトリックの出力をエクスポートする必要があるかどうかを選択します。
既定値は false で、背景を 0 に置き換えます。カルシウムレポーターのカメレオンを発現する花粉管、pH指示薬のフローリンを発現する花粉管、カルシウムレポーターNESYC 3.6を発現する根毛などのデータセットでAMEBaSを試験したところ、増殖方向、イメージング技術、蛍光レポーター、細胞の種類が異なっていても、正常に機能しました。必要なパッケージをインストールできるように、ブロックのセットを実行することを忘れないでください。
さらに、より正確な結果を得ることができるように、画像に合わせてシグマ値を調整することが重要です。得られたキモグラフを使用して、解答対象物の時空間ダイナミクスを解析できます。さらに、それを計算して、方法、成長、時系列を見つけて、適切なソリューションを分析できます。
