AMEBaS：偏振单细胞比例荧光延时的自动中线提取和背景减法

该方法量化了极化细胞沿其中线表达荧光报告基因或染料的时空动力学，用于特定感兴趣的实体，如肌动蛋白、离子或囊泡动力学。自动化版本消除了偏见并允许可扩展性，特别是对于手动以数字方式完成的任务，这些任务可能会变得耗时且主观。首先，打开 Jupyter Notebook 并读取延时文件，方法是访问 Google CoLab 交互式笔记本主页，或从 GitHub 下载并打开 AMEBaS_local IP YNN。

要使用本地版本为输入和输出数据准备目录设置，请将荧光延时摄影作为 TIF 或 DV 文件放在程序根文件夹中名为 data 的文件夹中。创建一个输出文件夹以接收生成的数据，然后运行安装代码块。如果在 Google CoLab 上使用笔记本，请执行设置代码块以自动生成数据和输出文件夹，然后运行文件输入代码块以通过单击播放按钮读取延时数据。

如果使用 Google CoLab，请单击选择文件按钮将延时摄影文件上传到数据文件夹。接下来，通过将 verbose 参数设置为 true 或 false，选择为每个步骤生成其他输出。要从背景中检测主单元格和片段，请单击播放按钮运行单单元格分割代码块，以自动将感兴趣的单元格与背景分离。

调整 sigma 变量中的 sigma 值以微调分割掩码的平滑度。默认值为 2.0。现在，将变量估计值设置为 false，以存储直接从 ISO 数据估计的阈值，或者将变量估计值设置为 true，以使用局部多项式回归在相邻帧中平滑该阈值。

调整 n_points 变量以微调函数，默认值为 40。要沿单元格扩展跟踪中线，请单击播放按钮运行单元格中线跟踪代码块，以使用 Lee 方法对单元格进行骨架化，并通过线性外推扩展最后一个骨架的尖端。接下来，通过调整 complete_skeletonization 参数来选择中线的跟踪选项，以跟踪最后一帧或每帧跟踪一次。

调整interpolation_fraction变量以设置骨架中用于外推期间插值的点的分数。此处的默认值为 0.25。接下来，修改 extrapolation_length 变量以确定中线外推的长度。

默认值为负 1，这会将骨架延伸到最近的边。现在，通过单击播放按钮运行第一个数据可视化代码块，以自动生成两个通道的 kymographs。通过调整 kymograph_kernel 变量来选择用于平滑的高斯核大小。

为了正确显示非延伸骨骼的强度，需要为其有盖的 kymograph 绘制自定义颜色图。调整shift_fraction变量以选择将指定为背景颜色黑色的强度百分比。然后通过单击播放按钮运行第二个数据可视化代码块，以自动生成比率指标 kymograph 和延时摄影。

调整 switch_ratio 变量以更改比率计算期间用作分子和分母的通道顺序，默认值为 false。通过调整smooth_ratio变量，检查比率延时是否需要使用中值滤波器通过进行额外的平滑处理。默认情况下，此值设置为 false。

接下来，通过调整reject_outliers变量，选择删除或保留分母通道中低信号导致的异常值。异常值标记为高于第三个四分位数的四分位距 1.5 倍的值。最后，通过调整变量background_ratio来选择是否需要导出背景和比率指标输出。

默认值为 false，用于将背景替换为零。AMEBaS 在表达钙报告基因骆驼的花粉管、表达 pH 指示剂 florin、表达钙报告基因 NESYC 3.6 的根毛等数据集上进行了测试，尽管在生长方向、成像技术、荧光报告基因和细胞类型方面存在差异，但仍成功运行。请记住执行块集，以便您可以安装所需的软件包。

此外，专门针对图像调整 sigma 值至关重要，这样您才能获得更准确的结果。然后，生成的kymographs可用于分析求解兴趣的时空动态。此外，您可以计算它的查找方法、增长和时间序列，以分析正确的解决方案。