Многие ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров, которые находятся на концах слуховых и вестибулярных афферентных нейронов, также находятся в их клеточных телах. Культуры изолированных клеточных тел могут быть изучены in vitro, чтобы понять, как эти ионные каналы и рецепторы влияют на реакцию нейронов. Компактная морфология клеточных тел позволяет проводить высококачественные электрические записи для характеристики потенциал-зависимых свойств ионных каналов и рецепторов нейротрансмиттеров.
Кроме того, легкий доступ к широкому спектру типов клеток обеспечивает высокую производительность за счет физического анализа разнообразия клеток. Процедуры будут продемонстрированы аспирантом Кэтрин Регаладо вместе с постдокторантами, доктором Дэниелом Бронсоном и Натаниэлем Новаком из моей лаборатории. Для начала поднесите стеклянную пастбищную пипетку к пламени горелки Бунзена, чтобы подготовить тритрирующие пипетки для диссоциации клеток.
Как только стеклянный наконечник начнет плавиться, растяните стекло до желаемого диаметра. Оттяните один конец пипетки от пламени, чтобы создать небольшой изгиб. Поместите изогнутую пипетку под микроскоп.
С помощью подрезной плитки надрежьте и разбейте стекло нужного диаметра. Пропустите наконечник пипетки над пламенем горелки. Это позволит быстро отполировать шероховатые края возле кончика.
Вычерпайте мозг усыпленной мыши с помощью закрытых хирургических ножниц. Отрежьте и удалите черепно-мозговой нерв, чтобы полностью отделить мозг от черепа. Начиная с затылка, снимите прозрачный мембранный материал щипцами, а затем вырежьте верхнюю часть черепа хирургическими ножницами.
Удалите лишнюю ткань с затылка и шеи, чтобы сделать область рассечения и капсулу яичной раковины более чистой и легкодоступной. Перенесите ткань во вторую чашку Петри со свежим раствором L-15. Затем локализуют ушную капсулу и слуховой, верхний, вестибулярный и нижний вестибулярные нервы.
Отделите верхний и нижний ганглии с помощью маленьких пружинных ножниц и отрежьте слуховой нерв. С помощью скальпеля аккуратно сбрейте костный гребень, чтобы ослабить костный участок, под которым нерв погружается в костную капсулу. Аккуратно удалите обломки скальпелем, обнажив всю опухшую часть ганглия.
С помощью тонких пружинных ножниц разрежьте и отделите ганглий от периферической нервной ветви, которая идет к утрикуле. Удалите верхний ганглий с помощью тонких щипцов и перенесите его в 35-миллиметровую чашку Петри со свежим раствором L-15. После предварительного нагрева ферментного раствора перелейте ферментную смесь в 35-миллиметровую чашку Петри и поместите ее в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 10-15 минут.
Очистите ганглий с помощью тонких щипцов и маленьких пружинных ножниц, удалив кость, лишнюю ткань, нервные волокна и любые другие лишние структуры. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму удаление любой ганглионарной ткани. Очищенные ганглии переложите в предварительно подогретый раствор фермента и поместите обратно в инкубатор на 10-40 минут.
Затем переложите ганглии в 35-миллиметровую чашку Петри со свежим раствором L-15. Через две-три минуты перенесите ганглии в другую 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную отфильтрованными питательными средами. Перелейте примерно 150 микролитров отфильтрованной питательной среды в чашку со стеклянным дном, покрытую покрытием.
Затем перенесите нужное количество ганглиев на покровный слип. Возьмите небольшое количество питательной среды из чашки для культивирования и промойте тритрированную пипетку средством, чтобы предотвратить прилипание ткани к стенкам стеклянной пипетки. Растирайте, осторожно и многократно пропуская ткань через пипетку до тех пор, пока ганглии не будут достаточно диссоциированы.
Через пять минут проверьте под световым микроскопом, осели ли клетки на покровном листе. Осторожно поместите чашку с культурой в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 12–24 часа. Затем найдите ушную капсулу после разделения головы пополам и извлеките ее из черепа, отколов края щипцами.
В спиральной части ушной капсулы находится улитка с органом Корти. Откалывают кость, перекрывая кохлеарные витки тонкими щипцами, параллельными изгибу кости. С помощью маленьких пружинных ножниц разрежьте модиол у основания улитки, чтобы освободить его от остальной части ушной капсулы.
Разрежьте орган корти на два-три витка маленькими пружинными ножницами так, чтобы он лежал ровно, и удалите модиол из каждого витка. Удалите сосудистую полосу, защипнув ее у основания тонкими щипцами. Раскрутите спираль и поднимитесь к вершине, чтобы освободить ее от органа Корти.
Удалите спиральный ганглий, надрезав на краю того места, где спиральные тракты ганглионарных нейронных волокон выступают в сторону волосковых клеток, а затем очистите ганглий, как показано ранее. После ферментативной обработки спирального ганглия тритратируют спиральный ганглий в питательной среде с добавлением N2 и B27. Поместите культуральную чашку, содержащую диссоциированные ганглии, в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5%-ным углекислым газом на 12–24 часа.
Опустите кончик пипетки в чистый раствор чашки для закваскивания, чтобы наполнить его чистым раствором, не содержащим амфотерицина. Заполните заднюю часть пипетки внутренним раствором, содержащим амфотерицин. Опустите кончик пипетки обратно в чистый раствор чашки для культивирования, в то время как амфотерицин медленно поступает в наконечник с задней стороны пипетки.
Затем заполните пипетку раствором амфотерицина на две трети пипетки. Опустите пипетку в ванну записывающей камеры и расположите наконечник пипетки в центре поля зрения. Убедитесь, что на наконечнике нет пузырьков воздуха или другого мусора.
Расположите пипетку близко к мембране и плотно приземлитесь на центр ячейки. Применяйте отрицательное давление или всасывание с помощью шприца или ротовой пипетки. Включите удерживающий потенциал минус 60 милливольт.
Сопротивление уплотнения должно увеличиваться до тех пор, пока оно не пройдет гигаом. Как только образуется гигаомное уплотнение, сбросьте отрицательное давление. Прежде чем тирозин начнет действовать, входное сопротивление медленно уменьшается, а ток, протекающий в ответ на шаг напряжения в пять милливольт, постепенно увеличивается по мере того, как амфотерицин входит в мембрану.
На рисунке показаны репрезентативные примеры токов всей клетки, вызванных нейроном вестибулярного ганглия. Суммарные входящие натриевые токи идентифицируются здесь по их переходной активации и инактивации. Суммарные внешние токи переносятся в основном ионами калия и имеют гораздо более медленную кинетику активации и инактивации, чем токи натрия.
Гиперполяризационные активированные циклические нуклеотидные зависимые токи, или токи HCN, активируются семейством длительных гиперполяризационных напряжений. Стабильность характеризации ионных каналов в перфорированном пятне в разные моменты времени во время регистрации показана на этом рисунке. Кривые активации токов HCN в зависимости от напряжения были измерены в конфигурации перфорированного патча.
Кривая имеет сигмоидальную форму и была стабильной на протяжении всей длительной записи. Относительная нестабильность режима разорванного патча иллюстрируется неперекрывающимися сигмоидальными кривыми из разных моментов времени. Здесь показаны кривые активации токов HCN при конфигурации разорванного участка.
Здесь показаны паттерны возбуждения в пяти вестибулярных ганглиозных сомарах, пяти спиральных ганглиозных нейронах и соответствующие текущие этапы. Эта гетерогенность в паттернах возбуждения отражает фундаментальное разнообразие в составе нижележащих натриевых и калиевых каналов как в нейронах вестибулярного ганглия, так и в нейронах спиральных ганглиозов. Чтобы максимизировать выживаемость клеток во время этой процедуры, избегайте образования пузырьков воздуха, не переутомляйте ткань и дайте клеткам осесть, прежде чем помещать образцы в инкубатор.
Перфорированный патч-зажим позволяет изучать ионные каналы, которые модулируются цитозольными вторичными мессенджерами, что имеет решающее значение для изучения влияния эфферентных нейротрансмиттеров на ганглиозные нейроны. Записи патч-зажимов этих биполярных нейронов сыграли важную роль в выявлении того, как биофизическое разнообразие способствует функциональному разнообразию сенсорных нейронов.
