Гематоспинномозговой барьер прочно связан и имеет ограниченную проницаемость. Этот протокол позволяет исследователям безопасно и временно открыть гематоспинномозговой барьер с помощью микропузырьков и сфокусированного ультразвука. Этот метод позволяет локализовать отверстие гематоспинномозгового барьера в целевом сегменте спинного мозга.
Кроме того, нарушение может быть легко подтверждено с помощью визуального наблюдения или флуоресцентной микроскопии. Этот протокол может быть изучен на предмет его потенциала в улучшении доставки генной терапии или лекарств в спинной мозг для лечения опухолей, атрофии или травм. Демонстрировать процедуру будет Мегана Бхимредди.
Блестящий студент из моей лаборатории, который ежедневно преодолевает разрыв между инженерией и медициной. Для начала приобретите систему сфокусированного ультразвукового датчика с характеристиками, достаточными для достижения гематоспинномозгового барьера, или отверстий BSCB у крыс. Закрепите напечатанный на 3D-принтере держатель зонда и водяной конус на датчике.
Убедитесь, что между диффузором и датчиком есть водонепроницаемое уплотнение. Прикрепите стерилизованную, акустически прозрачную, полиэфирную мембрану толщиной 50 микрон к нижней части водяного конуса с помощью резиновой ленты. Наполните водяной конус дегазированной и деионизированной водой с помощью впускной и выпускной трубок.
Избегайте пузырьков воздуха внутри диффузора, так как они могут нарушить акустическую связь между преобразователем и мишенью. На этом этапе майларовая мембрана должна быть слегка надута. Подключите к преобразователю приводную аппаратуру, содержащую генератор волн и усилитель радиочастотного привода.
Прикрепите стереотаксический манипулятор к фиксирующей пластине и прикрепите держатель щупа к кронштейну. Запишите вес самки крысы Спрэга-Доули, находящейся под наркозом, и выполните тест на защемление пальцев ног и хвоста, чтобы подтвердить анестезию. Поместите грелку и стерильную впитывающую салфетку на фиксирующую пластину.
Положите крысу на впитывающую прокладку. Нанесите глазную мазь и поместите ректальный термометр для контроля температуры тела. Пальпируют последнее ребро крысы, которое прикреплено к позвоночнику у 13-х грудных позвонков.
Используйте электрическую бритву, чтобы сбрить шерсть со спинной поверхности между последним ребром и шеей. Протрите открытые участки кожи марлей, смоченной в 10% йодоповидоне. Сделайте разрез по средней линии с помощью ножниц по радужной оболочке и рассеките фасцию до тех пор, пока остистые отростки и листовая пластинка не обнажутся.
Удаляйте кость смещенными кусачками и ножницами для радужной оболочки под углом, пока спинной мозг не обнажится. Закрепите крысу на фиксирующей пластине, зажав остистые отростки, прилегающие к ламинэктомии. Затем слегка потяните за зажимы, чтобы позвоночник натянулся.
Отрегулируйте положение датчика с помощью стереотаксического кронштейна до тех пор, пока он не окажется точно над местом ламинэктомии. Прикрепите лазерный аппарат ко дну водяного конуса и опускайте его до тех пор, пока лазерная точка не станет видимой. Затем отрегулируйте боковое положение преобразователя до тех пор, пока лазерная точка не окажется над целевым положением для разрушения BSCB.
Снимите лазерный аппарат и заполните пространство между конусом и спинным мозгом дегазированным ультразвуковым гелем, не вводя пузырьков воздуха. Установите параметры ультразвуковой обработки на выходной мощности преобразователя. Приготовьте микропузырьковый раствор согласно инструкции производителя.
Чтобы увеличить шансы на успешную катетеризацию вен хвоста, окуните хвост в теплую воду и наложите жгут у основания хвоста, чтобы увеличить диаметр вен. Затем введите катетер хвостовой вены 22 калибра и промойте 0,2 миллилитрами гепаринизированного физиологического раствора. Введите в катетер один миллилитр на килограмм 3%-ного синего красителя Эванса, или EBD.
Затем промойте катетер 0,2 миллилитрами гепаринизированного физиологического раствора. Подтвердите успешную катетеризацию хвостовой вены, проверив изменение синего цвета кожи, глаз или спинной спинномозговой вены крысы. Введите в катетер 0,2 миллилитра микропузырьков и промойте гепаринизированным физиологическим раствором перед началом ультразвуковой обработки.
После эвтаназии крысы извлеките спинной мозг и поместите его в 4%-ный параформальдегид при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На следующий день замените параформальдегид на ПБС. Чтобы визуализировать разрушение BSCB, изолируйте двухсантиметровый участок, окружающий место ультразвукового воздействия, с помощью лезвия бритвы.
Разделите срез на срезы толщиной 10 микрон с помощью микротома и покрасьте гематоксилин-эозиновым красителем. Для флуоресцентной микроскопии депарафинизируйте предметное стекло, содержащее участок спинного мозга, и контрокрасьте 25 микролитрами DAPI, растворенным в монтажной среде. Инкубируйте срезы при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут в темноте, чтобы предотвратить обесцвечивание.
После инкубации используйте флуоресцентный микроскоп, чтобы получить изображение всех предметных стекол. Изображение предметного стекла, окрашенного гематоксилином и эозином, с помощью светового микроскопа. Сосудистая сеть спинного мозга видна после ламинэктомии и показывает заднюю спинномозговую вену с несколькими более мелкими сосудами, испускающими латерально.
После внутривенной инъекции EBD окружающие ткани и сосудистая сеть спинного мозга стали синими. После ультразвуковой обработки над целевым местом становится видно синее пятно, указывающее на экстравазацию EBD в белую паренхиму из-за нарушения BSCB. Иссечение спинного мозга у крыс с помощью низкоинтенсивного сфокусированного ультразвука, или ультразвуковой обработки LIFU, подтвердило явную экстравазацию EBD в спинной мозг.
В то время как крысы с отрицательным контролем без лечения LIFU не показали экстравазации EBD. Спинной мозг с ультразвуковой терапией LIFU показал значительно большую интенсивность автофлуоресценции EBD, чем спинной мозг, не получивший ультразвуковой обработки. С одинаковой интенсивностью DAPI, присутствующей в обоих случаях.
Анализ гематоксилина и эозина не выявил повреждений нейронов, кровоизлияний или повреждений полостей в местах ультразвуковой обработки. В качестве сравнения показаны примеры повреждений шнура из-за хирургического неправильного обращения и мощного ультразвукового воздействия. У крыс, получавших микропузырьки и лечение LIFU, не наблюдалось изменений в моторных показателях, пре-ультразвуковой и пост-ультразвуковой терапии, а также в течение пятидневного периода выживаемости.
Минимальные изменения температуры спинного мозга наблюдались до, во время и после ультразвукового анализа. Важно ограничить хирургическое повреждение спинного мозга во время ламинэктомии. Визуализация окрашенных срезов H и E с помощью микроскопии покажет, произошли ли какие-либо повреждения.
После нарушения гематоэнцефалического барьера спинного мозга с помощью фокусного ультразвука животным могут быть введены противоопухолевые препараты или генная терапия. Результат определит, может ли этот метод улучшить доставку терапевтических средств и продлить выживаемость в условиях патологии спинного мозга.
