Для изучения теломерного взаимодействия белка и ДНК были использованы одномолекулярные методы. Тем не менее, получение одномолекулярных конструкций с теломерными повторяющимися мотивами остается сложной задачей. В этом протоколе мы описываем этапы экспрессии и очистки белка TRF2, подготовки теломерной ДНК, постановки одномолекулярных механических анализов и анализа полученных данных.
Инструменты с использованием одной молекулы являются мощными методами для изучения теломерных взаимодействий белка и ДНК. Одномолекулярные механические методы, такие как магнитный пинцет, оптический пинцет и АСМ, были использованы для исследования TRF2-зависимого искажения ДНК, выявления TRF2-опосредованного столбчатого стекирования теломерного хроматина человека и наблюдения за присутствием теломеразного катализа. Мы исследовали теломерные взаимодействия ДНК-белка с помощью одиночного молекулярного магнитного пинцета, что позволило точно измерить изменения в длине и продолжительности белок-ДНК-взаимодействий под действием приложенных сил.
На основе этих измерений мы вывели кинетику диссоциации теломерных комплексов ДНК-белок. Кроме того, было выявлено образование петель внутри этих комплексов. Многочисленные структуры теломер-связывающих белков в комплексе с ДНК были определены с помощью крио-ЭМ, рентгеновской кристаллографии и ЯМР.
Эти структурные открытия углубили наше понимание теломерных взаимодействий белка и ДНК. Для дальнейшего изучения динамики этих взаимодействий мы разработали одномолекулярные механические методы, специально предназначенные для изучения теломерных взаимодействий белка и ДНК. Инструменты с использованием одной молекулы являются мощными методами исследования взаимодействий белка и ДНК в теломерах.
Эти методы особенно ценны для топологических конформаций и анализа кинетики ассоциации и диссоциации белок-ДНК.
