I metodi a singola molecola sono stati utilizzati per studiare l'interazione proteina-DNA telomera. Tuttavia, la preparazione di costrutti di singole molecole con i motivi ripetitivi telomerici rimane un compito impegnativo. In questo protocollo, delineiamo le fasi per l'espressione e la purificazione della proteina TRF2, la preparazione del DNA telomerorico, l'impostazione di saggi meccanici a singola molecola e l'analisi dei dati risultanti.
Gli strumenti a singola molecola sono tecniche potenti per esplorare le interazioni proteina-DNA telomeriche. Metodi meccanici a singola molecola, come pinzette magnetiche, pinzette ottiche e AFM sono stati utilizzati per studiare la distorsione del DNA dipendente da TRF2, rivelare l'impilamento colonnare mediato da TRF2 della cromatina telomerica umana e osservare la presenza di catalisi della telomerasi tra le altre applicazioni. Abbiamo studiato le interazioni DNA-proteina telomeriche utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola, consentendo misurazioni precise dei cambiamenti nell'estensione e della durata delle interazioni proteina-DNA sotto forze applicate.
Da queste misurazioni, abbiamo derivato la cinetica di dissociazione dei complessi DNA-proteina telomerici. Inoltre, è stata rivelata la formazione di anse all'interno di questi complessi. Numerose strutture di proteine leganti i telomeri in complesso con il DNA sono state risolte utilizzando la crio-EM, la cristallografia a raggi X e la risonanza magnetica nucleare.
Queste intuizioni strutturali hanno fatto progredire la nostra comprensione delle interazioni proteina-DNA telomeriche. Per approfondire la dinamica di queste interazioni, abbiamo sviluppato un metodo meccanico a singola molecola specifico per lo studio delle interazioni proteina-DNA telomeriche. Gli strumenti a singola molecola sono tecniche potenti per studiare le interazioni proteina-DNA nei telomeri.
Questi metodi sono particolarmente utili per le conformazioni topologiche e per l'analisi della cinetica di associazione e dissociazione proteina-DNA.
