Métodos de molécula única têm sido usados para estudar a interação proteína-DNA telomérico. No entanto, a preparação de construções de molécula única com os motivos repetitivos teloméricos continua sendo uma tarefa desafiadora. Neste protocolo, descrevemos as etapas para expressar e purificar a proteína TRF2, preparar o DNA telomérico, configurar ensaios mecânicos de molécula única e analisar os dados resultantes.
Ferramentas de molécula única são técnicas poderosas para explorar as interações proteína-DNA telomérico. Métodos mecânicos de molécula única, como pinças magnéticas, pinças ópticas e AFM, têm sido usados para investigar a distorção do DNA dependente de TRF2, revelar o empilhamento colunar mediado por TRF2 da cromatina telomérica humana e observar a presença de catálise de telomerase, entre outras aplicações. Investigamos as interações DNA-proteína telomérica usando pinças magnéticas moleculares únicas, permitindo medições precisas das mudanças na extensão e nas durações das interações proteína-DNA sob forças aplicadas.
A partir dessas medições, derivamos a cinética de dissociação dos complexos DNA-proteína teloméricos. Além disso, a formação de loops dentro desses complexos foi revelada. Numerosas estruturas de proteínas de ligação telomérica em complexo com DNA foram resolvidas usando crio-EM, cristalografia de raios-X e RMN.
Esses insights estruturais avançaram nossa compreensão das interações proteína-DNA telomérico. Para investigar melhor a dinâmica dessas interações, desenvolvemos métodos mecânicos de molécula única especificamente para estudar as interações proteína-DNA telomérico. Ferramentas de molécula única são técnicas poderosas para investigar interações proteína-DNA nos telômeros.
Esses métodos são especialmente valiosos para conformações topológicas e análise da cinética de associação e dissociação proteína-DNA.
