Наши исследования направлены на оптимизацию подготовки антигена для анализов ингибирования гемагглютинации. Для повышения точности обнаружения антител к NDV мы предлагаем метод быстрой и точной подготовки раствора антигена 4-HAU. Анализ HI остается наиболее распространенным методом выявления антител к NDV.
Тем не менее, новые технологии, в том числе автоматизированные системы обработки жидкостей, высокопроизводительные серологические платформы и передовые инструменты визуализации, также могут быть интегрированы в анализ ГИ. Они обеспечивают более быстрый и точный анализ, особенно при работе с большими партиями. Мы разработали эффективный метод для более точного определения титров ГК стокового раствора антигена в сочетании со строгим методом обратного титрования и четко определенным процессом корректировки.
Такой подход обеспечивает точный метод и минимизирует вычислительные задачи, повышая эффективность и надежность тестов, а также способствуя улучшению эпиднадзора и контроля заболеваний в популяциях домашней птицы. Суспензия красных кровяных телец курицы и визуальное считывание результатов HA HI по-прежнему способствуют вариабельности. Наша лаборатория сосредоточится на стандартизации суспензии эритроцитов и изучении компьютерного зрения или других методов для оцифровки результатов анализа HA HI, снижения субъективности и повышения согласованности.
Для начала добавьте три миллилитра раствора Alserver в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Соберите по одному миллилитру крови из крыльевой вены каждого из трех неиммунных цыплят. Затем сразу же переложите собранную кровь в пробирку с антикоагулянтом и аккуратно перемешайте содержимое путем инверсии.
Наполните тюбик стерильным PBS, чтобы довести общий объем до 12 миллилитров. Аккуратно перемешайте раствор, чтобы обеспечить равномерное распределение компонентов. Затем поместите пробирку в центрифугу, оснащенную горизонтальным ротором, и центрифугуйте при температуре 500 G на 10 минут.
После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость и слой лейкоцитов из пробирки. С помощью пипетки переверните пипеткой один миллилитр гранулы эритроцитов в 99 миллилитров стерильного раствора PBS для приготовления 1%-ной суспензии эритроцитов. Чтобы восстановить лиофилизированный антиген, добавьте два миллилитра стерильного PBS в ампулу, содержащую его.
Аккуратно встряхните ампулу, чтобы содержимое полностью растворилось, и дайте ей постоять две-три минуты, чтобы свести к минимуму образование пузырьков. Аликвот восстановили раствор в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и хранят его в морозильной камере, установленной при температуре минус 20 градусов Цельсия, до использования. Для начала распределите 40, 80, 120 и 160 микролитров PBS соответственно в четыре соседние лунки одноразового 96-луночного планшета для микротитрования с V-образным дном.
Добавьте по 20 микролитров восстановленного антигена в каждую лунку и пипетируйте вверх и вниз 10 раз, чтобы создать разбавление. Затем четко обозначьте новую микротитровальную пластину для последующих этапов и раздайте по 25 микролитров PBS в каждую лунку рядами от одного до пяти. С помощью многоканальной пипетки поместите 25 микролитров разведенных растворов антигена в первые лунки рядов с первого по пятый.
Пипеткой подавайте содержимое вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы обеспечить равномерное распределение. Затем перелейте по 25 микролитров из первой лунки каждого ряда во вторую, тщательно перемешивая. Выбросьте 25 микролитров конечного раствора после 11-й колонки.
Затем добавьте 25 микролитров PBS и 1% суспензии куриных эритроцитов соответственно в каждую лунку, начиная с лунок, содержащих самую низкую концентрацию антигена. Поместите пластину для микротитрования на шейкер для микротарелок для тщательного перемешивания. Оставьте пластину в покое на столе при комнатной температуре примерно на 30 минут, чтобы эритроциты в 12-й колонне полностью остыли.
Рассчитайте коэффициент разведения для приготовления раствора антигена 4-HAU по приведенной здесь формуле. Определите общий объем необходимого раствора 4-HAU и требуемые объемы исходного раствора антигена и PBS по приведенной формуле. С помощью пипетки перенесите рассчитанный объем PBS в контейнер.
Добавьте соответствующий объем стокового раствора антигена и тщательно перемешайте для приготовления раствора антигена 4-HAU. Затем распределите 25, 50, 75, 100, 125 и 150 микролитров PBS в шесть соседних лунок микротитрового планшета. Добавьте 25 микролитров раствора антигена 4-HAU в каждую лунку и пипетируйте вверх и вниз 10 раз, чтобы обеспечить правильное разведение.
С помощью многоканальной пипетки перенесите по 25 микролитров каждого разведенного раствора антигена из начального ряда в лунки другого ряда. Затем добавьте 25 микролитров PBS в каждую лунку, а затем 25 микролитров 1%-ной суспензии куриных эритроцитов в каждую лунку. Поместите тарелку на шейкер для микропланшетов примерно на 20 секунд, чтобы тщательно перемешать содержимое.
Внимательно наблюдайте за закономерностями гемагглютинации в лунках и записывайте результаты.
