La nostra ricerca si concentra sull'ottimizzazione della preparazione dell'antigene per i saggi di inibizione dell'emoagglutinazione. Per migliorare l'accuratezza del rilevamento degli anticorpi NDV, forniamo un metodo per la preparazione rapida e accurata della soluzione di antigene 4-HAU. Il test HI rimane il metodo più comune per la rilevazione degli anticorpi NDV.
Tuttavia, nel test HI possono essere integrate anche nuove tecnologie, tra cui i sistemi automatizzati di manipolazione dei liquidi, le piattaforme sierologiche ad alto rendimento e gli strumenti di imaging avanzati. Consentono un'analisi più rapida e accurata, soprattutto quando si gestiscono lotti di grandi dimensioni. Abbiamo stabilito un metodo efficiente per la rilevazione più accurata dei titoli HA della soluzione madre di antigene, combinato con un rigoroso metodo di titolazione inversa e un processo di aggiustamento ben definito.
Questo approccio fornisce un metodo accurato e riduce al minimo le attività computazionali, aumentando l'efficienza e l'affidabilità dei test e contribuendo a migliorare la sorveglianza e il controllo delle malattie nelle popolazioni avicole. La sospensione dei globuli rossi di pollo e la lettura visiva dei risultati di HA HI contribuiscono ancora alla variabilità. Il nostro laboratorio si concentrerà sulla standardizzazione della sospensione di globuli rossi e sull'esplorazione della visione artificiale o di altri metodi per digitalizzare i risultati del saggio HA HI, riducendo la soggettività e migliorando la coerenza.
Per iniziare, aggiungere tre millilitri di soluzione Alserver in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 millilitri. Raccogli un millilitro di sangue dalla vena alare di ciascuno dei tre polli non immuni. Quindi, trasferire immediatamente il sangue raccolto nella provetta anticoagulante e mescolare delicatamente il contenuto per inversione.
Riempire la provetta con PBS sterile per portare il volume totale a 12 millilitri. Mescolare delicatamente la soluzione per garantire una distribuzione uniforme dei componenti. Quindi, posizionare la provetta in una centrifuga dotata di rotore orizzontale e centrifugare a 500 G per 10 minuti.
Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante e lo strato di globuli bianchi dalla provetta. Utilizzando una pipetta, pipettare al contrario un millilitro di pellet di globuli rossi in 99 millilitri di soluzione sterile di PBS per preparare una sospensione di globuli rossi all'1%. Per ricostituire l'antigene liofilizzato, aggiungere due millilitri di PBS sterile alla fiala che lo contiene.
Agitare delicatamente la fiala per sciogliere completamente il contenuto e lasciarla riposare per due o tre minuti per ridurre al minimo la formazione di bolle. Aliquotare la soluzione ricostituita in provette da centrifuga da 1,5 millilitri e conservarla in un congelatore impostato a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per iniziare, erogare rispettivamente 40, 80, 120 e 160 microlitri di PBS in quattro pozzetti adiacenti di una piastra monouso per microtitolazione con fondo a V da 96 pozzetti.
Aggiungere 20 microlitri di antigene ricostituito a ciascun pozzetto e pipettare su e giù 10 volte per creare una diluizione. Quindi, etichettare chiaramente una nuova piastra per microtitolazione per le fasi successive ed erogare 25 microlitri di PBS in ciascun pozzetto nelle file da uno a cinque. Utilizzando una pipetta multicanale, posizionare 25 microlitri di soluzioni di antigene diluite nei primi pozzetti delle file da uno a cinque.
Pipettare il contenuto su e giù almeno cinque volte per garantire una distribuzione uniforme. Quindi, trasferire 25 microlitri dal primo pozzetto di ogni fila al secondo pozzetto, mescolando accuratamente. Scartare 25 microlitri della soluzione finale dopo l'11a colonna.
Quindi, aggiungere rispettivamente 25 microlitri di PBS e l'1% di sospensione di globuli rossi di pollo a ciascun pozzetto, iniziando dai pozzetti contenenti la concentrazione di antigene più bassa. Posizionare la piastra per microtitolazione sull'agitatore per micropiastre per mescolare accuratamente. Lasciare la piastra indisturbata sul banco di lavoro a temperatura ambiente per circa 30 minuti per consentire ai globuli rossi nella 12a colonna di depositarsi completamente.
Calcolare il fattore di diluizione per la preparazione della soluzione di antigene 4-HAU utilizzando la formula mostrata qui. Determinare il volume totale della soluzione di 4-HAU necessaria e i volumi richiesti della soluzione madre di antigene e del PBS utilizzando la formula indicata. Utilizzando una pipetta, trasferire il volume calcolato di PBS in un contenitore.
Aggiungere il volume corrispondente di soluzione madre di antigene e mescolare accuratamente per preparare la soluzione di antigene 4-HAU. Quindi, erogare 25, 50, 75, 100, 125 e 150 microlitri di PBS in sei pozzetti adiacenti di una piastra per microtitolazione. Aggiungere 25 microlitri della soluzione di antigene 4-HAU a ciascun pozzetto e pipettare su e giù 10 volte per garantire una corretta diluizione.
Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 25 microlitri di ciascuna soluzione di antigene diluita dalla fila iniziale nei pozzetti di un'altra fila. Quindi, aggiungere 25 microlitri di PBS in ciascun pozzetto, seguiti da 25 microlitri di una sospensione di globuli rossi di pollo all'1% in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra su uno shaker per micropiastre per circa 20 secondi per mescolare accuratamente il contenuto.
Osservare attentamente i modelli di emoagglutinazione nei pozzetti e registrare i risultati.
