Araştırmamız, hemaglutinasyon inhibisyon testleri için antijen preparatını optimize etmeye odaklanmaktadır. NDV antikor tespit doğruluğunu artırmak için, 4-HAU antijen çözeltisi için hızlı ve doğru hazırlık için bir yöntem sunuyoruz. HI testi, NDV antikor tespiti için en yaygın yöntem olmaya devam etmektedir.
Bununla birlikte, otomatik sıvı işleme sistemleri, yüksek verimli serolojik platformlar ve gelişmiş görüntüleme araçları dahil olmak üzere yeni teknolojiler de HI testine entegre edilebilir. Özellikle büyük parti boyutlarını işlerken daha hızlı ve daha doğru analiz sağlarlar. Antijen stok çözeltisinin HA titrelerinin daha doğru bir şekilde tespit edilmesi için titiz bir geri titrasyon yöntemi ve iyi tanımlanmış bir ayarlama süreci ile birlikte etkili bir yöntem oluşturduk.
Bu yaklaşım, doğru bir yöntem sağlar ve hesaplama görevlerini en aza indirir, test verimliliğini ve güvenilirliğini artırır ve kanatlı popülasyonlarında hastalık sürveyansı ve kontrolünün iyileştirilmesine katkıda bulunur. Tavuk kırmızı kan hücrelerinin süspansiyonu ve HA HI sonuçlarının görsel olarak okunması hala değişkenliğe katkıda bulunur. Laboratuvarımız, RBC süspansiyonunu standartlaştırmaya ve HA HI tahlil sonuçlarını dijitalleştirmek, öznelliği azaltmak ve tutarlılığı artırmak için bilgisayarla görme veya diğer yöntemleri keşfetmeye odaklanacaktır.
Başlamak için, steril, 15 mililitrelik konik bir santrifüj tüpüne üç mililitre Alserver çözeltisi ekleyin. Bağışık olmayan üç tavuğun her birinin kanat damarından bir mililitre kan toplayın. Daha sonra, toplanan kanı hemen antikoagülan tüpe aktarın ve içeriği ters çevirerek hafifçe karıştırın.
Toplam hacmi 12 mililitreye getirmek için tüpü steril PBS ile doldurun. Bileşenlerin eşit dağılımını sağlamak için çözeltiyi nazikçe karıştırın. Ardından, tüpü yatay bir rotorla donatılmış bir santrifüje yerleştirin ve 10 dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı ve beyaz kan hücresi tabakasını tüpten dikkatlice çıkarın. Bir pipet kullanarak, %1'lik bir RBC süspansiyonu hazırlamak için RBC peletinin bir mililitresini 99 mililitre steril PBS çözeltisine ters pipetleyin. Liyofilize antijeni yeniden oluşturmak için, onu içeren ampule iki mililitre steril PBS ekleyin.
İçeriği tamamen çözmek için ampulü hafifçe sallayın ve kabarcık oluşumunu en aza indirmek için iki ila üç dakika bekletin. Aliquot, çözeltiyi 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine yeniden yapılandırdı ve kullanana kadar eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir dondurucuda saklayın. Başlamak için, sırasıyla 40, 80, 120 ve 160 mikrolitre PBS'yi tek kullanımlık 96 oyuklu V-tabanlı mikrotitre plakasının dört bitişik kuyusuna dağıtın.
Her bir oyuğa 20 mikrolitre sulandırılmış antijen ekleyin ve seyreltme oluşturmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, sonraki adımlar için yeni bir mikrotitre plakasını net bir şekilde etiketleyin ve her bir oyuğa bir ila beşinci sıralar halinde 25 mikrolitre PBS dağıtın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 25 mikrolitre seyreltilmiş antijen çözeltisini bir ila beşinci sıraların ilk oyuklarına yerleştirin.
Eşit dağılımı sağlamak için içeriği en az beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, her sıranın ilk kuyucuğundan 25 mikrolitreyi ikinci kuyucuğa aktarın ve iyice karıştırın. 11. sütundan sonra 25 mikrolitre nihai çözeltiyi atın.
Daha sonra, en düşük antijen konsantrasyonunu içeren kuyucuklardan başlayarak her bir oyuğa sırasıyla 25 mikrolitre PBS ve% 1 tavuk RBC süspansiyonu ekleyin. İyice karıştırmak için mikrotitre plakasını mikroplaka çalkalayıcıya yerleştirin. 30. sütundaki RBC'lerin tamamen oturmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında yaklaşık 12 dakika tezgah üzerinde rahatsız edilmeden bırakın.
Burada gösterilen formülü kullanarak 4-HAU antijen çözeltisini hazırlamak için seyreltme faktörünü hesaplayın. Verilen formülü kullanarak ihtiyaç duyulan 4-HAU çözeltisinin toplam hacmini ve gerekli antijen stok çözeltisi ve PBS hacimlerini belirleyin. Bir pipet kullanarak, hesaplanan PBS hacmini bir kaba aktarın.
Karşılık gelen hacimde antijen stok çözeltisi ekleyin ve 4-HAU antijen çözeltisini hazırlamak için iyice karıştırın. Ardından, 25, 50, 75, 100, 125 ve 150 mikrolitre PBS'yi bir mikrotitre plakasının altı bitişik kuyusuna dağıtın. Her oyuğa 25 mikrolitre 4-HAU antijen çözeltisi ekleyin ve uygun seyreltmeyi sağlamak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, her seyreltilmiş antijen çözeltisinin 25 mikrolitresini ilk sıradan başka bir sıranın kuyucuklarına aktarın. Daha sonra, her bir oyuğa 25 mikrolitre PBS ekleyin, ardından her oyuğa 25 mikrolitre% 1 tavuk RBC süspansiyonu ekleyin. İçeriği iyice karıştırmak için plakayı yaklaşık 20 saniye boyunca bir mikroplaka çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
Kuyucuklardaki hemaglutinasyon modellerini dikkatlice gözlemleyin ve sonuçları kaydedin.
