ニューカッスル病ウイルス血清学の血球凝集阻害アッセイのための抗原調製物の最適化

私たちの研究は、赤血球凝集阻害アッセイのための抗原調製の最適化に焦点を当てています。NDV抗体の検出精度を向上させるため、4-HAU抗原溶液を迅速かつ正確に調製する方法を提供しています。HIアッセイは、NDV抗体検出の最も一般的な方法であることに変わりはありません。

ただし、自動リキッドハンドリングシステム、ハイスループット血清学的プラットフォーム、高度なイメージングツールなどの新技術もHIアッセイに統合できます。これにより、特に大きなバッチサイズを処理する場合に、より迅速で正確な分析が可能になります。私たちは、抗原ストック溶液のHA力価をより正確に検出するための効率的な方法を確立し、厳格なバック滴定法と明確な調整プロセスを組み合わせて確立しました。

このアプローチは、正確な方法を提供し、計算タスクを最小限に抑え、検査の効率と信頼性を向上させ、家禽集団の疾病監視と制御の改善に貢献します。ニワトリの赤血球懸濁液とHA HI結果の視覚的読み出しは、依然としてばらつきの一因となっています。私たちの研究室では、RBC懸濁液の標準化と、HA HIアッセイの結果をデジタル化するためのコンピュータービジョンまたはその他の方法の探求に焦点を当て、主観性を減らし、一貫性を高めます。

まず、3ミリリットルのAlserver溶液を滅菌済みの15ミリリットルの円錐形遠心チューブに加えます。免疫のない3羽の鶏のそれぞれの翼静脈から1ミリリットルの血液を採取します。その後、採取した血液を直ちに抗凝固チューブに移し、内容物を反転させて穏やかに混合します。

チューブに滅菌PBSを充填して、総容量を12ミリリットルにします。溶液を穏やかに混合して、成分が均一に分布するようにします。次に、チューブを水平ローターを備えた遠心分離機に入れ、500Gで10分間遠心分離します。

遠心分離後、上清と白血球層をチューブから慎重に取り除きます。ピペットを使用して、1ミリリットルのRBCペレットを99ミリリットルの滅菌PBS溶液に逆ピペットで入れ、1%RBC懸濁液を調製します。凍結乾燥抗原を再構成するには、それを含むアンプルに2ミリリットルの滅菌PBSを追加します。

アンプルを静かに振って内容物を完全に溶かし、気泡の形成を最小限に抑えるために2〜3分間放置します。アリコートは溶液を1.5ミリリットルの遠心分離管に再溶解し、マイナス20°Cに設定された冷凍庫で使用まで保存します。まず、40、80、120、および160マイクロリットルのPBSを、使い捨ての96ウェルVボトムマイクロタイタープレートの4つの隣接するウェルにそれぞれ分注します。

再構成した抗原を20マイクロリットルずつ各ウェルに加え、ピペットで10回上下に動かして希釈します。次に、後続のステップのために新しいマイクロタイタープレートに明確にラベルを付け、25マイクロリットルのPBSを1列目から5列目の各ウェルに分注します。マルチチャンネルピペットを使用して、希釈した抗原溶液25マイクロリットルを列1〜5の最初のウェルに入れます。

内容物を少なくとも5回上下にピペットで動かして、均一に分布するようにします。次に、各列の最初のウェルから2番目のウェルに25マイクロリットルを移し、完全に混合します。11列目以降、最終溶液の25マイクロリットルを廃棄します。

次に、抗原濃度が最も低いウェルから始めて、各ウェルにそれぞれ25マイクロリットルのPBSと1%チキンRBC懸濁液を追加します。マイクロタイタープレートをマイクロプレートシェーカーに置き、十分に混合します。プレートをベンチトップの室温で約30分間放置し、12列目のRBCが完全に沈殿するまで待ちます。

4-HAU抗原溶液を調製するための希釈係数を、ここに示す式で計算します。必要な4-HAU溶液の総量と、抗原ストック溶液とPBSの必要量を、所定の式を用いて決定します。ピペットを使用して、計算されたPBSの量を容器に移します。

対応する量の抗原ストック溶液を加え、十分に混合して4-HAU抗原溶液を調製します。次に、25、50、75、100、125、および150マイクロリットルのPBSをマイクロタイタープレートの6つの隣接するウェルに分注します。各ウェルに25マイクロリットルの4-HAU抗原溶液を加え、ピペットで10回上下させて適切な希釈を確保します。

マルチチャンネルピペットを使用して、希釈した各抗原溶液の25マイクロリットルを最初の列から別の列のウェルに移します。次に、各ウェルに25マイクロリットルのPBSを加え、続いて各ウェルに25マイクロリットルの1%チキンRBC懸濁液を加えます。プレートをマイクロプレートシェーカーに約20秒間置き、内容物を完全に混合します。

ウェル内の赤血球凝集パターンを注意深く観察し、結果を記録します。