Эта тайна может помочь ответить на несколько вопросов в области клеточной биологии, таких как ввод белка в хлоропласты. Основным преимуществом этой технологии является то, что ввод белка в хлоропласты может быть изучен в условиях en vivo. Демонстрация процедуры будет Junho Ли и Hyangju Кан, два поста выходы из моей лаборатории.
Для начала, урожай нетронутыми листовых тканей из двухнедельных растений от одной до двух пластин B5. Используйте хирургический нож, чтобы собрать листья и поместить их в 50 миллилитров конической трубки, содержащей 25 миллилитров ферментного раствора. Поместите трубку горизонтально на роторный шейкер и инкубировать с нежным возбуждением при 22 градусах по Цельсию в темноте в течение восьми-12 часов, пока в растворе не останутся только петиолы и стебли.
После завершения инкубации, фильтр ферментный раствор, содержащий выпущенные протопласты через сетку размером 140 микрометров в свежую чашку Петри. Затем осторожно слой раствора поверх 15 миллилитров 21% раствора сахарозы в 50 миллилитров конической трубки. Центрифуга трубки в размахивая ротор ведро на 98 г в течение 10 минут с наименьшим ускорением и замедлением настройки.
После этого используйте патура пипетку, чтобы тщательно удалить протопласты из верхнего слоя, содержащего ферментный раствор, и из интерфейса между раствором ферментов и раствором сахарозы. Перенесите этот раствор в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 30 миллилитров раствора W5, и переверните трубку для смешивания. Центрифуга трубки на 51 г в течение шести минут.
Используйте пипетку, чтобы аккуратно отказаться от этого супернатанта, не нарушая протопласты в гранулах. Добавьте 25 миллилитров раствора W5 и аккуратно повторно приостановите протопласты. Для стабилизации инкубировать в холодильнике по четыре по Цельсию в течение как минимум одного часа.
После четырех градусов по Цельсию инкубации, гранулы протопласты полностью центрифугирования их на 46 г в течение двух минут. Аккуратно удалите супернатант полностью и добавьте раствор MANG в протопластовые гранулы, чтобы достичь пяти раз десять к шести на миллилитр. Используйте пипетку, чтобы добавить 10 микрограммов ДНК плазмы и 300 микролитров протопластового раствора в свежую 13-миллилитровую круглую нижнюю трубку.
Смешайте, аккуратно вращая трубки вручную, а затем сразу добавьте 300 микролитров свежеприготовленного 40%PEG раствора. Смешайте полностью, наклоняя трубку почти горизонтально и вращая ее нежно несколько раз вручную. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
Затем добавьте один миллилитр раствора W5 и полностью перемешайте, аккуратно вращая трубку вручную, как и раньше. Инкубировать образец в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторите еще два раза с добавлением сначала 1,5 миллилитров, а затем два миллилитров W5 и после окончательного добавления и смешивания, инкубировать в течение 30 минут.
Центрифуга трубки на 46 г в течение четырех минут, а затем отказаться от супернатанта. Добавьте в гранулы два миллилитров раствора W5 и смешайте аккуратно, но полностью, так же, как и раньше. Инкубировать при 22 градусах по Цельсию в темной камере в течение 18 часов.
Для анализа импорта белка с помощью микроскопии флуоресценции используйте пипетку с подстриженным наконечником, чтобы поместить 10 микролитров раствора протопласта на стеклянную горку. Используйте крышку скольжения тщательно покрыть решение, чтобы избежать повреждения протопластов. Поместите слайд на стадии флуоресцентного микроскопа с фильтром приема возбуждения, который устанавливается для наблюдения зеленого флуоресцентного белка и хлорофилла аутофторесценции.
Используйте охлажденую камеру устройства для захвата изображений и обработки их с помощью программного обеспечения для редактирования изображений псевдоцвета. Для общего извлечения белка и иммуноблоттинга удалите один миллилитр из раствора протопласта и смешайте оставшийся миллилитр. Перенесите этот протопластический раствор в центрифугу и центрифугу при 46 г в течение четырех минут.
Удалите супернатант после завершения центрифугации и добавьте 80 микролитров буфера денатурации. Вихрь энергично в течение пяти секунд. Добавьте пять буферов образца XDS, хорошо перемешайте и варите в течение 10 минут, чтобы денатуратура.
Продолжить со стандартной страницей STS и иммуноблоттинга с анти-GFP антитела. RbcS и TGFT, термоядерная конструкция, кодирующей 79 конечных терминалов аминокислотных остатков РБКС, содержащих транзитный пептид, сплавленный в GFP, были использованы для изучения импорта белков в хлоропласты с помощью микроскопии флорескции и иммуноблоттинга. При осмотре микроскопией флорескции зеленые флуоресцентные сигналы от целевого белка слились с красными флуоресцентными сигналами от хлорофилла, указывающими на импорт белка в хлоропласты.
После изоляции общего белка, две белковые полосы наблюдаются в иммуноблоте, показывая, что белок был правильно импортирован в хлоропласты. Верхняя полоса соответствует прекурсору полной длины и нижней полосе обработанной форме после импорта в хлоропласты. Количество обработанной формы белка увеличивается во времени зависимым образом, что позволяет предположить, что белок импортируется в хлоропласты.
При этом развитии, этот метод проложил путь для исследователей в области клеточной биологии для изучения белка утомительно или мембраны нить сбора в Arabidopsis.
