Этот метод обеспечивает эффективную альтернативу традиционному аналоговому подходу в получении аминокислотных перепроизводов. Этот метод выходит из традиционного аналогового метода, обеспечивая точность, чувствительность и высокую пропускную способность одновременно. Этот метод проливает новый свет на понимание сильных сторон перепроизводства аминокислот и перевод редких кодонов и теоретически может быть применен ко всем микроорганизмам.
Этот протокол опирается главным образом на основные молекулярно-экспериментальные операции, которые легко следовать, но может потребовать нескольких испытаний для того, чтобы достичь подходящего выбора напрягающих строк. Визуальная демонстрация этого метода дает прямую оценку эффективности отбора и системы скрининга при выявлении производителей аминокислот. Чтобы начать эту процедуру, добавьте вектор в фрагменты маркера, на льду, в молярном соотношении от одного до одного-семи тока пять микролитров сборки смешиваются с общим объемом десять микролитров.
Инкубировать при 50 градусах по Цельсию в течение одного часа. Превратите пять микролитров сборочного продукта в 50 микролитров компонентных ячеек при 42 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Восстановление клеток в супер оптимальный бульон с Катаболит репрессии среды при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.
Затем, пластины их на LB Агар среднего и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию. На следующий день используйте предпочтительный коммерческий комплект, чтобы изолировать плазмиду. Во-первых, трансформировать 50 микролитров компетентных клеток с одним микролитером плазмиды, которая несет дикий тип KanR.
Преобразуй второй набор компетентных клеток с плазмидой, содержащей KanR RC 29 со всеми кодонами лейцина, замененными редким кодоном CTA. Плита и инкубация клеточной культуры, как указано в текстовом протоколе. Затем перенесите колонии, в которых находится ген маркера отбора дикого типа в богатой редким кодоном производные по отдельности, в пять миллилитров пятикратной разбавленной среды LB, содержащей канамицин при концентрации 50 микрограмм на миллилитр.
Инкубировать образцы в шейкере при 37 градусах по Цельсию при тряске при 250 об/мин. Затем перенесите 200 микролитров каждой из клеточных культур в 96 хорошо пластины в тройной в определенных точках времени. Используйте считыватель пластин для измерения OD600.
Прививка пятна укрывательство KanR RC 29 маркер гена в двух наборах из пяти миллилитров 0,2 х LB среды, которая содержит канамицин, с или без поставки L-лейцина. Добавьте L-лейцин в один из средств массовой информации к конечной концентрации одного грамма на литр. Инкубировать образцы в шейкере при 37 градусах по Цельсию при тряске при 250 об/мин и измерить OD600 для каждой культуры в определенных точках времени.
Для начала преобразуй 50 микролитров родительского штамма, используемого для мутагенеза, с помощью одного микролитера плазмиды, который несет в себе GFP дикого типа или PPG дикого типа. Плита и инкубация клеточных культур, изложенных в текстовом протоколе. Затем перенесите колонии индивидуально на пять миллилитров правильно разбавленной среды LB.
Инкубировать образцы в шейкере при 37 градусах по Цельсию при тряске при 250 об/мин. Для маркеров флуоресценции, передача 200 микролитров клеточных культур в 96 хорошо ясно нижней задней пластины в тройной в определенные точки времени. Измерьте OD600 при флуоресценции и рассчитайте интенсивность флуоресценции.
Для хромогенных маркеров, измерить цвет развития клеточных культур. Выполните анализ кормления, как описано ранее, и измерьте интенсивность флуоресценции или развитие цвета в определенных точках времени. Во-первых, трансформировать 50 микролитров мутантных клеток с одним микролитером плазмиды с маркером отбора KanR RC 29, или скрининговые маркеры GFP RC или PPG RC. Далее центрифуга клеточных культур в 4000 раз G в течение пяти минут.
Для выбора отбросьте супернатант и добавьте пять миллилитров среды 0,2 х LB, содержащей канамицин, в клетки с маркером отбора. Инкубировать образец на ночь в шейкере при 37 градусах по Цельсию. На следующий день, пластины ночной культуры на 0,2 х LB агар среды, содержащей канамицин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 12 часов.
Для скрининга, пластины соответствующее количество клеток укрывательство скрининг маркер на LB агар среды, содержащей соответствующий антибиотик. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение восьми часов. После этого, привить LB среды, содержащие соответствующие антибиотики с каждой отдельной колонии от пластины.
Инкубировать образцы в шейкере при 37 градусах по Цельсию при тряске при 250 об/мин. Измерьте OD600 и флуоресценцию и рассчитайте интенсивность флуоресценции при использовании GFP RC. Измерьте развитие цвета клеточных культур, если используется PPG RC.
Чтобы проверить аминокислоты производительности штаммов кандидата, подготовить семена культуры путем инокуляции пять миллилитров LB среды с каждым из кандидатов штаммов и пусть клетки растут на ночь в шейкере при 250 об / мин и при 37 градусов по Цельсию. На следующий день, урожай клеток из одного миллилитра клеточной культуры путем центрифугирования в 4000 раз G в течение двух минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте палитру одним миллилитром стерильной воды.
Прививка 20 миллилитров M9 среды, содержащей четыре процента глюкозы с 200 микролитров клеточной подвески и инкубировать в 250 миллилитров шейкер при 250 об / мин и при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день центрифуга один миллилитр среды культуры на 4000 раз G в течение пяти минут. Перенесите 200 микролитров супернатанта в чистую 1,5 миллилитровую трубку.
Подготовье стандартных решений L-лейцина в концентрациях, показанных здесь. В дымовой капот добавьте 100 микролитров одного миллимоляра триэтиламина и 100 микролитров одного моларного фенила изотиоцианата как к супернатанту, так и к стандартам. Смешайте растворы осторожно и инкубировать их при комнатной температуре в течение одного часа.
Затем добавьте 400 микролитров n-hexane в ту же трубку и вихрем его в течение десяти секунд. Нижняя фаза содержит аминокислотные производные и используется для анализа HPLC. Фильтр нижней фазы через 0,2 микролитровых полиэтиленовых мембран.
После этого запустите один микролитр образца на ультра HPLC, оснащенном колонкой C18 со скоростью потока 0,42 миллилитров в минуту и при температуре колонки 40 градусов по Цельсию. Используйте детектор диодного массива для обнаружения целевых аминокислот на 254 нанометров и расчета их концентраций путем картирования пиковых областей в соответствии со стандартной кривой. В этом исследовании, аминокислоты overproducers определены с помощью редких кодон богатых маркеров одновременно достичь точности, чувствительности и высокой пропускной способности.
Для системы отбора следует наблюдать резкое снижение OD600 для штаммов, питающих редкий ген устойчивости к антибиотикам, богатый кодоном, по сравнению с штаммом, укрывавным дикий тип. Ингибирование редкого кодона на белковых выражениях в основном происходит в голодных условиях. После дополнительного кормления соответствующей аминокислоты, OD600 для штамма укрывательство редких кодон богатых антибиотиков устойчивость гена значительно возрастает.
Для системы скрининга интенсивность флуоресценции в количестве флуоресцентных клеток значительно ниже для штамма, который выражает флуоресцентный белок из редкого гена, богатого кодоном, чем из гена дикого типа. Кормление соответствующей аминокислоты восстановит белковые выражения из редких генов, богатых кодоном. При использовании фиолетового белка цвет, разработанный из редкой PPG, богатой кодоном, легче, чем у гена дикого типа.
Неразбавленная среда LB позволяет медленное выражение редкой PPG, богатой кодоном, без L-лейцинового кормления в выраженном фиолетовом белке становится видимым после того, как клетки гранулированы. Тем не менее, это не скрывает того факта, что экспрессия генов из редких кодон богатых PPG усиливается путем кормления L-лейцина. Редкая стратегия на основе кодона может выявить перепроизводов целевых аминокислот из библиотеки мутаций, и эти мутанты должны производить большее количество целевых аминокислот, чем родительские штаммы.
При попытке этой процедуры, важно настроить частоту редкого кодона для достижения четкой дискриминации в OD или цвет между клетками укрывательство диких маркеров типа и редких codon богатых производных. Транскриптомный анализ и секвенирование генома могут быть применены к выбранным штаммам для исследования механизма, связанного с аминокислотными производствами. Используя этот метод, аминокислоты overproducers могут быть эффективно определены и анализ их генетической информации будет предлагать новые идеи в свои механизмы за аминокислоты перепроизводства.
Аминокислотная производная может быть вредной. Убедитесь в том, чтобы носить перчатки и защитную одежду и выполнять эти шаги в дым капот.
