Лигнин представляет собой сложный гетерополимер, состоящий из трех монолигнолов. Это второй по распространенности полимер на земле после целлюлозы. Здесь мы демонстрируем метод тиогликолевой кислоты, который является наиболее надежным методом оценки содержания лигнина.
Этот метод основан на принципе, что лигнин связывается с тиогликолевой кислотой через тиоэфирные связи. Далее мы разделили этот протокол на пять этапов. На первом этапе мы готовим растительный материал.
Во второй фазе мы выделим спирт нерастворимый экстракт. На третьей фазе мы выпадаем в осадок лигнин, используя тиогликолевую кислоту и кислые условия. На четвертом этапе мы готовим стандартную кривую лигнина с использованием промышленного бамбукового лигнина.
Наконец, на пятом этапе мы оцениваем содержание лигнина, используя стандартную кривую, подготовленную на четвертой фазе. Растительный материал собирают, переворачивают горшки, чтобы отделить корни, тщательно промывают их в воде, сушат на воздухе в течение двух дней, переносят в маркированные емкости и инкубируют в инкубаторе при 49 градусах по Цельсию в течение одной недели до 10 дней. С помощью ножниц ткань далее разрезается на кусочки размером от 1 мм до 3 мм.
В качестве альтернативы измельчитель биомассы используется для измельчения растительных тканей. Используйте корневую ткань Включите измельчитель биомассы, соберите измельченный порошок в предварительно маркированные контейнеры. Аналогично повторите для ткани стебля и ткани листа.
Измельченный порошок загружается в шлифовальную вазу, которая затем помещается в морозильную мельницу и запускает морозильную мельницу со скоростью 10 CP в течение трех циклов. Взвесите 20 мг измельченного тканевого порошка и переложите в предварительно изготовленную трубку объемом 2 мл. Запишите пустую трубку и трубку с тканевым порошком и тканевым порошком в лабораторном блокноте.
Высиживать трубки с крышкой, открытой при 60 градусах по Цельсию, в течение одного часа. После инкубации добавляют 1,8 мл воды в каждую вихревую центрифугу образца при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта Добавьте 1,8 мл метанола.
Вихрь и инкубация в предварительно нагретом 60-градусном по цельсию блоке в течение 20 минут После инкубации центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Повторите этот шаг еще раз. После центрифугирования откажитесь от супернатанта и высушите гранулы в вакуумной сушилке в течение двух-трех часов или до полного высыхания поддона.
Измерьте и запишите вес каждой трубки в лабораторной записной книжке для оценки содержания лигнина в конце. Также включают положительный контроль промышленного бамбукового лигнина в этот момент начиная с 0,5 мг до 4 мг в трипликатах. Добавьте 1 мл 3 обычных соляных кислот вместе с сотней микролитров гликолевой кислоты в каждый образец Vortex и инкубировать при 80 градусах цельсия в течение 3 часов.
Через 3 часа инкубации переложите их в стойку и дайте остыть в течение 10 минут. затем центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования цвет раствора выглядит так.
Выбросьте супернатант. Добавить 1 мл воды. Вихревая центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут.
Выбросьте супернатант. Добавить 1 мл 1 нормального гидроксида натрия. Вихрь и инкубируют при 37 градусах по Цельсию шейкер в течение ночи.
После ночной инкубации центрифугируют трубки при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Перенесите супернатант в свежие предварительно меченые пробирки объемом 2 мл, добавьте к супернатанту 200 микролитров концентрированной соляной кислоты. Смешайте их путем мягкой инверсии, как показано здесь.
Высиживать их в холодильнике при 4 градусах по Цельсию на ночь. После инкубации центрифугу при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Выбросьте супернатант.
Добавить 1 мл гидроксида натрия. Вихрь и инкубировать в шейкере при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Используйте спектрофотометр для сбора показаний поглощения 280 нанометров, возьмите 2 микролитра гидроксида натрия в качестве пустой, так как осажденный лигнин растворен в гидроксиде натрия.
Сделайте пустое до нуля. Аналогично повторите для образцов. Используйте два микролитра каждого образца для сбора показаний поглощения в лабораторной записной книжке.
Возьмите три показания для каждого образца для трех технических реплик. В первом столбце у нас есть номер образца. Во втором столбце мы имеем биологические реплики, где R1, R2, R3 представляют собой три биологические реплики одной экспериментальной линии.
В третьем столбце мы усредняли показания поглощения, полученные на уровне 280 нанометров. Мы рассчитали содержание лигнина в четвертом столбце по формуле y=mx-c, где x — средний OD.m а значения c строятся из линии регрессии подготовленной стандартной кривой. Пятая колонка - это вес после промывки метанола и воды.
Таким образом, это способ, который используется для оценки содержания лигнина в мг. Таким образом, мы делим значение, полученное в четвертом столбце, на пятое столбец, чтобы получить значение на мг содержания лигнина в шестом столбце. И это значение умножается на 1000 для того, чтобы получить на грамм вес клеточной стенки.
А процентное содержание лигнина вычисляется путем деления этого значения на 1000 и умножения на 100. Наконец, мы получаем средний лигнин путем усреднения лигнина трех биологических реплик каждой экспериментальной линии, который будет сравниваться со средним значением другой экспериментальной линии в виде гистограммы, чтобы понять различия в содержании лигнина. Мы также можем применить студенческий t-тест для проверки их уровня значимости.
В колонке А у нас есть коммерческий бамбуковый лигнин, а затем вес бамбукового лигнина, который был взят до TGA, и их соответствующие показания поглощения на уровне 280 нанометров. Эти значения в таблице A использовались для построения рассеянного графика в столбце B, который дает нам линию регрессии со значениями m и c. В C мы сравнили значения, полученные с помощью стандартной кривой, а экспериментальные линии промышленного бамбукового лигнина один и два сравнивались в виде гистограммы, и в результате они показывают разницу между собой.
