Наши исследования сосредоточены на использовании уникальных свойств гранулированных гидрогелей для изучения движения клеток и функций регенерации тканей. Реакцию клеток на микроокружение важно смоделировать для понимания последствий для трансляционного воздействия. По мере роста использования каркасов 3D-портов растет и потребность в комплексных анализах 3D-миграции, которые лучше воспроизводят поведение клеток в среде заживления ран.
Мы разработали два трехмерных конвейера, от разработки скаффолда до визуализации и анализа, для исследования движения и миграции клеток in vitro. С помощью этих двух новых анализов мы получили возможность отслеживать чувствительные клетки на двух различных стадиях заживления раны: первоначальная инфильтрация каркаса из объемной ткани и движение клеток в окружении сложного каркаса. Для начала на планшете 120 000 клеток дермальных фибробластов человека на квадратный сантиметр по меньшей мере в шести лунках 96-луночного планшета.
После ночной инкубации извлеките среды из лунок клеток с помощью аспиратора или пипетки. Добавьте краситель в количестве 20 микролитров каждого геля в лунки с помощью пипетки прямого вытеснения. Используя насадку для центрифуги с вращающимся ротором пластины, установленную на 25 градусов Цельсия, вращайте пластину при 100 g в течение 15 секунд с ускорением и замедлением, установленными на 8, чтобы разгладить гель.
Переверните пластину на 180 градусов и снова вращайте, чтобы обеспечить равномерное распределение геля по дну лунки. Чтобы асептически сшить гель, примените сфокусированный свет с яркостью 365 нанометров в течение 30 секунд для отжига каркаса. После формирования всех скаффолдов добавьте по 200 микролитров среды в каждую лунку и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Используйте конфокальный микроскоп для визуализации клеток и фиксации их миграционного поведения. Для анализа изображений откройте программное обеспечение Imaris Image Conversion Software для пакетного преобразования. Перетащите изображения микроскопии в программное обеспечение для преобразования и выберите папку в программном обеспечении для импорта файлов.
Выберите каждый файл по отдельности, чтобы установить размер вокселя. Нажмите кнопку Начать все, чтобы начать преобразование. Затем в программном обеспечении Imaris Arena выберите изображение с арены, чтобы начать обработку.
Нажмите на вкладку «Профи изображений» на главной панели инструментов. Теперь нажмите на выпадающее меню для Channel 1 и выберите «Вычитание фона». Нажмите OK, чтобы вернуться к 3D-виду.
На небольшой панели инструментов нажмите на иконку с закругленными синими формами с надписью «Добавить новые поверхности», чтобы создать редактируемую вкладку объектов с именем «Поверхности 1». Вручную сгенерируйте параметры для всех реплик с помощью кнопки с синей стрелкой. Установите детализацию поверхности на 0,7 микрометра и выберите Вычитание фона, Локальный контраст.
Введите среднюю длину ячейки в диаметр самой большой сферы, которая помещается в поле объекта. Для порогового значения определите гистограмму интенсивности, чтобы сегментировать только самые яркие ячейки. Включите функции «Разделить соприкасающиеся объекты», «Увеличение области» и установите диаметр исходных точек в соответствии с ранее использованным диаметром.
Чтобы сохранить параметры создания для пакетного анализа, нажмите на значок палочки с надписью Создание. Нажмите кнопку Сохранить параметры для пакета, присвойте файлу имя и нажмите кнопку ОК. Чтобы собрать все высоты ячеек, нажмите на вкладку Подробно. Выберите определенные значения, а затем выберите Положение Z в раскрывающихся меню.
Нажмите значок «Сохранить», чтобы экспортировать все позиции и классификации Z в файл XLS. Для начала налейте PBS в чашку Петри под ламинарным колпаком и пипеткой капли 20 микролитров раствора клеточной среды на перевернутую крышку чашки Петри. Установите крышку обратно на чашку и инкубируйте тарелку, чтобы получить висячие 3D-сфероиды, культивируемые каплями.
Чтобы установить PLOSMA, используйте пипетку прямого вытеснения, чтобы асептически добавить 15 микролитров геля в лунки прозрачной 96-луночной пластины. Используя насадку для центрифуги с вращающимся ротором пластины, вращайте пластину со скоростью 1 000 г в течение 10 секунд, чтобы разровнять гель. Переверните пластину на 180 градусов и снова поверните, чтобы обеспечить равномерное распределение геля.
Затем примените сфокусированный свет на 365 нанометров в течение 30 секунд, чтобы отжечь каркас и сшить гель сверху на фото. Асептически переместите чашку Петри с висящими каплями в вытяжку для культуры тканей и заверните крышку. С помощью пипетки объемом 20 микролитров медленно отсасывайте каплю, пока сфероид не войдет в наконечник пипетки, и выбросьте каплю на каркас в центре лунки.
Инкубируйте луночную пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы сфероиды могли прикрепиться к каркасу. После инкубации нанесите пипеткой дополнительно 15 микролитров геля поверх каждого сфероида. Центрифугируйте планшет при 300 г в течение 15 секунд в каждом направлении, чтобы обеспечить равномерное распределение геля.
Отжигаем верхний слой геля для использования ультрафиолета, как было показано ранее. Поместите планшет под конфокальный микроскоп и получите изображение сфероидов после выбора самой нижней и самой высокой Z-плоскостей. После импорта изображений в программное обеспечение Imaris Arena щелкните раскрывающееся меню для канала 1 и выберите «Вычитание фона».
Нажмите OK в нижней части панели. В 3D-виде нажмите «Автонастройка всех каналов» во всплывающем окне «Настройка дисплея» и внесите необходимые корректировки. На меньшей панели инструментов нажмите значок «Добавить новую рамку отсчета», чтобы создать вкладку под названием «Рамка отсчета 1».
Переместите начало координат к центру сфероида во всех трех плоскостях. На той же панели инструментов нажмите на иконку с оранжевыми сферами, чтобы добавить новые пятна, создав вкладку с именем Пятна 1, и нажмите кнопку с синей стрелкой, чтобы продолжить. Для пороговых значений настройте гистограмму интенсивности, чтобы сегментировать только самые яркие части.
Используйте срез для навигации по стеку изображений для обеспечения точности. Нажмите синюю стрелку «Далее» три раза. Снимите флажок «Рендер на срезе» или нажмите на желтый квадратный значок на панели настройки.
Перейдите на вкладку «Статистика». В выпадающих меню выберите конкретные значения и расстояние от исходной системы отсчета. Нажмите значок «Сохранить».
Чтобы сохранить все изменения и анализы, нажмите значок «Сохранить» на главной панели инструментов. Этот метод был использован для оценки клеточной инфильтрации на границе раздела тканей. Медианное положение по оси Z мигрирующих клеток значительно увеличилось с нуля до 24 часов, что указывает на заметное вертикальное перемещение клеток.
Кратное изменение миграции клеток по оси Z удвоилось через 24 часа. Клетки, засеянные методом PLOSMA, продемонстрировали значительное распространение и миграцию из сфероидного ядра через 24 часа. Трехмерные рендеры показали обширное распространение ячеек в каркасе PLOSMA через 24 часа, с видимыми проекциями, простирающимися наружу.
Обработанные 3D-изображения с использованием функции Spots выявили дисперсные положения клеток в каркасе, что указывает на широко распространенную миграцию. Клетки преодолевали в среднем расстояние более 200 микрометров с одинаковыми результатами на всех образцах. Изменение высоты Z ячеек в каркасе PLOSMA составило примерно 4, что указывает на существенное движение вверх.
