Nossa pesquisa se concentra na utilização das propriedades únicas dos hidrogéis granulares para investigar o movimento celular e as funções para a regeneração do tecido. A resposta celular ao microambiente é importante para modelar na compreensão das implicações para o impacto translacional. À medida que o uso de andaimes de porta 3D aumenta, também aumenta a necessidade de ensaios abrangentes de migração 3D que repliquem melhor o comportamento celular em um ambiente de cicatrização de feridas.
Desenvolvemos dois pipelines tridimensionais, desde o desenvolvimento de andaimes até a imagem e análise, para investigar o movimento e a migração celular in vitro. Com esses dois novos ensaios, ganhamos a capacidade de rastrear as células responsivas em dois estágios distintos da cicatrização de feridas: infiltração inicial de andaime de tecido a granel e movimento celular, uma vez cercado por um andaime complexo. Para começar, coloque 120.000 células de fibroblastos dérmicos humanos por centímetro quadrado em pelo menos seis poços de uma placa de 96 poços.
Após a incubação durante a noite, remova o meio dos poços das células usando um aspirador ou pipeta. Adicione o corante em 20 microlitros de cada condição de gel aos poços usando uma pipeta de deslocamento positivo. Usando um acessório de centrífuga de rotor giratório de placa ajustado a 25 graus Celsius, gire a placa a 100g por 15 segundos com aceleração e desaceleração definidas para 8 para achatar o gel.
Vire a placa 180 graus e gire novamente para garantir uma distribuição uniforme do gel no fundo do poço. Para reticular assepticamente o gel, aplique luz focalizada a 365 nanômetros por 30 segundos para recozer o andaime. Depois de formar todos os andaimes, adicione 200 microlitros de meio a cada poço e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Use um microscópio confocal para obter imagens das células e capturar seu comportamento de migração. Para análise de imagem, abra o software de conversão de imagem Imaris para conversões em lote. Arraste e solte imagens de microscopia no software de conversão e selecione uma pasta dentro da arena do software para importar os arquivos.
Selecione cada arquivo individualmente para definir o tamanho do voxel. Pressione Iniciar tudo para iniciar a conversão. Em seguida, no software Imaris Arena, selecione uma imagem da arena para iniciar o processamento.
Clique na guia Profissionais de imagem na barra de ferramentas principal. Agora, clique no menu suspenso do Canal 1 e selecione Subtração em segundo plano. Pressione OK para retornar à visualização 3D.
Na barra de ferramentas pequena, clique no ícone com formas azuis arredondadas rotuladas Adicionar novas superfícies para criar uma guia de objetos editáveis chamada Superfícies 1. Gere manualmente parâmetros para todas as réplicas usando o botão de seta azul. Defina o detalhe da superfície para 0,7 micrômetros e selecione Subtração do plano de fundo, Contraste local.
Insira o comprimento médio da célula no diâmetro da esfera maior, que cabe na caixa do objeto. Para limiar, determine o histograma de intensidade para segmentar apenas as células mais brilhantes. Ative Dividir objetos em contato, Região crescente e defina o diâmetro dos pontos iniciais para corresponder ao diâmetro usado anteriormente.
Para salvar os parâmetros de criação para análise em lote, clique no ícone de varinha rotulado Criação. Clique em armazenar parâmetros para lote, nomeie o arquivo e clique em OK. Para reunir todas as alturas das células, clique na guia Detalhado. Selecione valores específicos e, em seguida, Posição Z nos menus suspensos.
Clique no ícone Salvar para exportar todas as posições e classificações Z para um arquivo XLS. Para começar, despeje PBS em uma placa de Petri sob a capa laminar e pipete gotículas de 20 microlitros da solução de mídia celular na tampa invertida da placa de Petri. Coloque a tampa de volta no prato e incube o prato para obter esferóides 3D cultivados em gotículas pendurados.
Para configurar o PLOSMA, use uma pipeta de deslocamento positivo para adicionar assepticamente 15 microlitros do gel aos poços de uma placa transparente de 96 poços. Usando um acessório de centrífuga de rotor giratório de placa, gire a placa a 1.000g por 10 segundos para achatar o gel. Vire a placa 180 graus e gire novamente para garantir uma distribuição uniforme do gel.
Em seguida, aplique luz focalizada a 365 nanômetros por 30 segundos para recozer o andaime e reticular o gel de cima. Mova assepticamente a placa de Petri de gotículas penduradas na capa de cultura de tecidos e inverta a tampa. Usando uma pipeta de 20 microlitros, aspire lentamente uma gota até que o esferóide entre na ponta da pipeta e ejete a gota no andaime no andaime no centro do poço.
Incube a placa do poço a 37 graus Celsius por duas horas para permitir que os esferoides se prendam ao andaime. Após a incubação, pipete mais 15 microlitros de gel em cima de cada esferoide. Centrifugue a placa a 300g por 15 segundos em cada direção para garantir uma distribuição uniforme do gel.
Recozer a camada superior do gel para usar luz ultravioleta, conforme demonstrado anteriormente. Coloque a placa sob um microscópio confocal e obtenha imagens dos esferóides após selecionar os planos Z mais baixos e mais altos. Depois de importar as imagens para o software Imaris Arena, clique no menu suspenso do Canal 1 e selecione Subtração em segundo plano.
Pressione OK na parte inferior do painel. Na visualização 3D, pressione Ajustar automaticamente todos os canais na janela pop-up Ajuste de exibição e faça as correções necessárias. Na barra de ferramentas menor, clique no ícone Adicionar novo quadro de referência para criar uma guia denominada Quadro de referência 1.
Mova a origem para o centro do esferóide em todos os três planos. Na mesma barra de ferramentas, clique no ícone com esferas laranja para adicionar novos pontos, criando uma guia chamada Pontos 1, e pressione o botão de seta azul para prosseguir. Para limite, ajuste o histograma de intensidade para segmentar apenas as partes mais brilhantes.
Use a segmentação de dados para navegar pela pilha de imagens para obter precisão. Pressione a seta azul Avançar três vezes. Desmarque Renderizar na segmentação ou clique no ícone quadrado amarelo no painel de configuração.
Clique na guia Estatísticas. Nos menus suspensos, selecione valores específicos e distância do quadro de referência de origem. Clique no ícone Salvar.
Para salvar todas as alterações e análises, clique no ícone Salvar na barra de ferramentas principal. Este método foi utilizado para avaliar a infiltração celular em uma interface tecidual. A posição mediana no eixo Z das células migratórias aumentou significativamente de zero a 24 horas, indicando notável movimento celular vertical.
A mudança de dobra na migração celular ao longo do eixo Z dobrou após 24 horas. As células semeadas usando o método PLOSMA demonstraram espalhamento e migração significativos do núcleo esferóide após 24 horas. As renderizações tridimensionais mostraram extensa expansão celular no andaime PLOSMA após 24 horas, com projeções visíveis estendendo-se para fora.
As imagens 3D processadas usando a função Spots revelaram posições de células dispersas no andaime, indicando migração generalizada. As células percorreram uma distância média de mais de 200 micrômetros com resultados consistentes entre as amostras. A mudança de dobra da altura Z das células no andaime PLOSMA foi de aproximadamente 4, indicando um movimento ascendente substancial.
