Araştırmamız, hücre hareketini ve doku yenilenmesi için işlevleri araştırmak için granül hidrojellerin benzersiz özelliklerini kullanmaya odaklanmaktadır. Mikro çevreye hücre tepkisi, translasyonel etkinin etkilerini anlamada modellemek için önemlidir. 3D port iskelelerinin kullanımı arttıkça, yara iyileşme ortamında hücre davranışını daha iyi kopyalayan kapsamlı 3D göç testlerine olan ihtiyaç da artmaktadır.
Hücre hareketini ve göçünü in vitro olarak araştırmak için iskele geliştirmeden görüntüleme ve analize kadar üç boyutlu iki boru hattı geliştirdik. Bu iki yeni tahlille, yara iyileşmesinin iki farklı aşamasında yanıt veren hücreleri izleme yeteneği kazandık: toplu dokudan ilk iskele infiltrasyonu ve karmaşık bir iskele ile çevrelendikten sonra hücre hareketi. Başlamak için, 96 oyuklu bir plakanın en az altı oyuğunda santimetre kare başına 120.000 insan dermal fibroblast hücresi plaka.
Gece boyunca inkübasyondan sonra, ortamı bir aspiratör veya pipet kullanarak hücre kuyularından çıkarın. Boyayı, her jel koşulundan 20 mikrolitre olarak, pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak kuyucuklara ekleyin. 25 santigrat dereceye ayarlanmış bir plaka eğirme rotoru santrifüj ataşmanı kullanarak, jeli düzleştirmek için plakayı 100 g'da 15 saniye boyunca hızlanma ve yavaşlama ile 8 saniye döndürün.
Plakayı 180 derece çevirin ve kuyu dibinde eşit jel dağılımı sağlamak için tekrar döndürün. Jeli aseptik olarak çapraz bağlamak için, iskeleyi tavlamak için 30 saniye boyunca 365 nanometrede odaklanmış ışık uygulayın. Tüm iskeleleri oluşturduktan sonra, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre ortam ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Hücreleri görüntülemek ve göç davranışlarını yakalamak için konfokal bir mikroskop kullanın. Görüntü analizi için, toplu dönüştürmeler için Imaris Görüntü Dönüştürme Yazılımı'nı açın. Mikroskopi görüntülerini dönüştürme yazılımına sürükleyip bırakın ve dosyaları içe aktarmak için yazılım alanında bir klasör seçin.
Voksel Boyutunu ayarlamak için her dosyayı ayrı ayrı seçin. Dönüştürmeyi başlatmak için Tümünü Başlat'a basın. Ardından, Imaris Arena Yazılımında, işlemeye başlamak için arenadan bir görüntü seçin.
Ana araç çubuğundaki Görüntü Uzmanları sekmesine tıklayın. Şimdi, Kanal 1 için açılır menüyü tıklayın ve Arka Plan Çıkarma'yı seçin. 3D görünüme dönmek için Tamam'a basın.
Küçük araç çubuğunda, Yüzeyler 1 adlı düzenlenebilir nesneler sekmesi oluşturmak için Yeni Yüzeyler Ekle etiketli yuvarlatılmış mavi şekillere sahip simgeyi tıklatın. Mavi ok düğmesini kullanarak tüm çoğaltmalar için parametreleri el ile oluşturun. Yüzey ayrıntısını 0,7 mikrometre olarak ayarlayın ve Arka Plan Çıkarma, Yerel Kontrast'ı seçin.
Ortalama hücre uzunluğunu, nesne kutusuna sığan en büyük kürenin çapına girin. Eşikleme için, yalnızca en parlak hücreleri segmentlere ayırmak üzere yoğunluk histogramını belirleyin. Dokunarak Nesneleri, Bölge Büyütme'yi etkinleştirin ve tohum noktaları çapını daha önce kullanılan çapla eşleşecek şekilde ayarlayın.
Toplu analiz için oluşturma parametrelerini kaydetmek için, Oluşturma etiketli değnek simgesine tıklayın. Toplu iş için parametreleri depola'ya tıklayın, dosyayı adlandırın ve Tamam'a tıklayın. Tüm hücre yüksekliklerini toplamak için Ayrıntılı sekmesine tıklayın. Belirli değerleri seçin ve ardından açılır menülerden Z Konumu'nu seçin.
Tüm Z konumlarını ve sınıflandırmalarını bir XLS dosyasına aktarmak için Kaydet simgesine tıklayın. Başlamak için, PBS'yi laminer başlığın altındaki bir Petri kabına dökün ve 20 mikrolitrelik hücre ortamı çözeltisi damlacıklarını Petri kabının ters çevrilmiş kapağına pipetleyin. Kapağı tekrar tabağa yerleştirin ve asılı damlacık kültürlü 3D sferoidler elde etmek için plakayı inkübe edin.
PLOSMA'yı kurmak için, 96 oyuklu şeffaf bir plakanın kuyucuklarına aseptik olarak 15 mikrolitre jel eklemek için pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanın. Bir plaka eğirme rotoru santrifüj ataşmanı kullanarak, jeli düzleştirmek için plakayı 1.000 g'da 10 saniye döndürün. Plakayı 180 derece çevirin ve eşit jel dağılımı sağlamak için tekrar döndürün.
Ardından, iskeleyi tavlamak ve jeli üstten çapraz bağlamak için 30 saniye boyunca 365 nanometrede odaklanmış ışık uygulayın. Asılı damlacıklardan oluşan Petri kabını aseptik olarak doku kültürü başlığına taşıyın ve kapağı ters çevirin. 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, küre pipet ucuna girene kadar bir damlacığı yavaşça aspire edin ve damlacığı kuyunun ortasındaki iskeleye atın.
Kürelerin iskeleye yapışmasına izin vermek için kuyu plakasını 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir sferoidin üzerine 15 mikrolitre daha jel pipetleyin. Eşit jel dağılımını sağlamak için plakayı 300 g'da her yönde 15 saniye santrifüjleyin.
Daha önce gösterildiği gibi ultraviyole ışığı kullanmak için jelin üst tabakasını tavlayın. Plakayı konfokal bir mikroskop altına yerleştirin ve en düşük ve en yüksek Z-düzlemlerini seçtikten sonra sferoidleri görüntüleyin. Görüntüleri Imaris Arena Yazılımı'na aktardıktan sonra, Kanal 1 için açılır menüyü tıklayın ve Arka Plan Çıkarma'yı seçin.
Panelin altındaki Tamam'a basın. 3D görünümde, Display Adjustment (Ekran Ayarı) açılır penceresindeki Auto Adjust All Channels (Tüm Kanalları Otomatik Ayarla) düğmesine basın ve gereken düzeltmeleri yapın. Daha küçük araç çubuğunda, Referans Çerçevesi 1 etiketli bir sekme oluşturmak için Yeni Referans Çerçevesi Ekle simgesini tıklatın.
Her üç düzlemde de orijini sferoidin merkezine taşıyın. Aynı araç çubuğunda, yeni noktalar eklemek için turuncu küreli simgeye tıklayın, Noktalar 1 adlı bir sekme oluşturun ve devam etmek için mavi ok düğmesine basın. Eşikleme için, yoğunluk histogramını yalnızca en parlak kısımları segmentlere ayıracak şekilde ayarlayın.
Doğruluk için görüntü yığınında gezinmek için dilimleyiciyi kullanın. Mavi renkli İleri okuna üç kez basın. Render on Slicer seçeneğinin işaretini kaldırın veya kurulum panelindeki sarı kare simgesine tıklayın.
İstatistikler sekmesine tıklayın. Açılır menülerde, belirli değerleri ve kaynak referans çerçevesine olan mesafeyi seçin. Kaydet simgesine tıklayın.
Tüm değişiklikleri ve analizleri kaydetmek için ana araç çubuğundaki Kaydet simgesine tıklayın. Bu yöntem, bir doku arayüzünde hücresel infiltrasyonu değerlendirmek için kullanıldı. Göç eden hücrelerin Z eksenindeki medyan pozisyon, sıfırdan 24 saate önemli ölçüde artmıştır ve bu da kayda değer dikey hücre hareketini gösterir.
Z ekseni boyunca hücre göçündeki kat değişimi 24 saat sonra iki katına çıktı. PLOSMA yöntemi kullanılarak tohumlanan hücre, 24 saat sonra sferoid çekirdekten önemli ölçüde yayılma ve göç gösterdi. Üç boyutlu görüntüler, 24 saat sonra PLOSMA iskelesinde geniş hücre yayılımını gösterdi ve görünür çıkıntılar dışa doğru uzanıyordu.
Noktalar İşlevi kullanılarak işlenen 3D görüntüler, iskeledeki dağınık hücre konumlarını ortaya çıkardı ve bu da yaygın göçü gösterdi. Hücreler, numuneler arasında tutarlı sonuçlarla ortalama 200 mikrometrenin üzerinde bir mesafe kat etti. PLOSMA iskelesindeki hücrelerin Z-yükseklik kat değişimi yaklaşık 4 idi ve bu da önemli ölçüde yukarı doğru hareketi gösteriyordu.
