Подходы структурной биологии и аналитической химии для характеристики метаболических ферментов С-гликозида в микробиоте кишечника человека. Протокол. Во-первых, производство и очистка белка. Построение вектора выражения.
Получите последовательность кластера генов GenBank LC422372.1 от NCBI. Клонируйте гены в модифицированный вектор pET-28a. Трансформируйте плазмиды в компетентные клетки E.coli BL21 DE3.
Затем культивируют бактерии в среде LB с 50 мкг канамицина на миллилитр при 37 градусах. Добавляйте 0,2 миллимоля IPTG в среду, когда бактериальная плотность OD600 достигнет 0,6. Культивируйте бактерии при температуре 16 градусов в течение 16 часов.
Центрифугируйте бактериальную культуру при 4 000 умноженных g при четырех градусах. Выбросьте надосадочную жидкость и сохраните бактериальную гранулу. Ресуспендировать бактериальную гранулу в буфере А. Очистка белка.
Добавьте один миллимоль PMSF в бактериальную ресуспензию. Лизировать бактериальную суспензию с помощью ультразвукового клеточного разрушителя. Центрифугируйте бактериальный лизат при 48 000 умноженных на g в течение 40 минут при четырех градусах.
Очистите белок в надосадочной жидкости с помощью колонки NTA с аффинной хроматографией никеля. Разбавьте связанный белок буфером B в градиенте. Соберите образцы с высоким поглощением ультрафиолетового излучения 280 нанометров и прозрачными полосами белка из SDS-PAGE для следующего шага.
Диализируйте образцы с помощью буфера C. Очистите диализованный белок с помощью ионообменной хроматографической колонки. Свяжите целевой белок с колонкой с помощью буфера C. Разбавьте связанный белок ингредиентом буфера D. Очистите белок с помощью колонки исключения размера с буфером E.Collect образцы белка для следующего шага.
Сконцентрируйте образцы белка до 20 миллиграммов на миллилитр, аликвотируйте его, быстро заморозьте жидким азотом. Храните его при температуре 80 градусов впрок. Измерьте концентрацию белка с помощью QuickDrop с УФ-излучением 280 нанометров.
Круговой дихроизм, CD, сбор спектральных данных. Разбавьте белки до 0,2 мг на миллилитр в одном буфере PBS, pH 7,4. Установите скорость сканирования прибора на 50 нанометров в минуту и спектральную полосу пропускания на один нанометр.
Сбор спектральных данных CD в диапазоне длин волн от 200 до 260 нанометров. Вычтите фон PBS и возьмите среднее значение из трех измерений. Во-вторых, кристаллография белков и определение структуры.
Рост и оптимизация кристаллов белка. Проводят первичный скрининг кристаллизации методом сидячих капель с использованием наборов для кристаллизации белка на 48-луночных кристаллических планшетах. Установите градиенты осадителя и концентрации белка для оптимизации кристаллизации белка методом висячих капель.
Перенесите кристаллы в раствор для замачивания, содержащий буфер резервуара и целевые соединения при температуре 16 градусов в течение 30 минут после полного роста. Перенесите кристаллы в криопротекторный раствор, содержащий кристаллизационный буфер с добавлением 25% глицерина и немедленно хранящийся в жидком азоте для сбора данных. Сбор данных и структурное определение кристаллов белка.
Соберите полный набор данных рентгеновской дифракции на линиях пучков ССРФ NFPS С использованием падающей длины волны 0,978 ангстрема. Обрабатывайте данные дифракции кристаллов первоначально с помощью программного обеспечения для обработки кристаллографических данных. Проводите поэтапное выполнение с помощью программы автоматической обработки данных.
Используйте программное обеспечение для определения кристаллической структуры для автоматического уточнения и оптимизации модели структуры. В-третьих, мониторинг активности реакции и определение кинетических параметров. Мониторинг активности DgpA/B/C с помощью ВЭЖХ.
Соберите реакционную систему расщепления C-гликозида в буфере PBS, pH 7,4, содержащем 20 микромолей на миллилитр DgpA/B/C, один миллимоль на литр иона марганца, один миллимоль на литр NAD, 10 миллимоль на литр DTT и 0,1 миллимоля на литр субстрата, пуэрарин, даидзин, генистин. Тщательно перемешайте с помощью пипетки и выдержите при температуре 37 градусов в течение восьми часов. Добавьте в систему реакции в три раза больше метанола, чтобы завершить реакцию.
Центрифугируйте реакционный раствор при 16 000 раз g в течение 15 минут, чтобы удалить осадок. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтрующей мембраны толщиной 0,22 микрометра. Выполняйте анализ ВЭЖХ с градиентным элюированием со скоростью потока один миллилитр в минуту, детектированием длины волны УФ 265 нанометров и объемом впрыска 10 микролитров.
Мониторинг активности DgpA с помощью 2, 6-дихлорфенола индофенола, DCPIP, анализ. Инкубируйте 0,8 ммоль на литр DCPIP, 50 микромолей на литр белка и 10 миллимоль на литр субстрата в одном буфере PBS, pH 7,4. После 20 часов реакции запишите изменение поглощения DCPIP на 600 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов.
Определение скорости ингибирования глюкозы в реакции расщепления С-гликозидной связи пуэрина. Проводят реакцию в буфере с однократным PBS, pH 7,4, при различных концентрациях глюкозы в реакционной системе, как описано в разделе 3.1. Проводите реакцию при 37 градусах в течение 12 часов.
Выполняйте количественный анализ сгенерированных продуктов с помощью ВЭЖХ. Определение кинетических параметров. Концентрация пуэрарина установлена в диапазоне от 0,01 до четырех миллимоль на литр, а дайдзина и генистина составляла от 0,01 до двух миллимоль на литр в реакции расщепления DgpA/B/C C-гликозида.
Проводите реакцию при температуре 37 градусов в течение восьми часов в соответствии с методом, описанным в разделе 3.1. Получите кинетические параметры Km и kcat путем подгонки рассчитанной скорости реакции и концентрации субстрата к модели Михаэлизы-Ментена в Prism. Четвертое, приготовление и обнаружение промежуточного продукта реакции.
Приготовление промежуточного продукта реакции. Используйте дайдзин и генистин в качестве субстратов для проведения реакции в соответствии со способами, описанными в разделе 3.1, с реакционной системой объемом 90 миллилитров. Очистите промежуточный продукт с помощью препаративной ВЭЖХ с колонкой для препаративной жидкостной хроматографии.
Очищенные промежуточные продукты высушите вакуумным центробежным концентратором впрок. Характеристика промежуточного продукта реакции с ЖХ-МС. Часть очищенных промежуточных продуктов из реакций дайдзина и генистина растворить в метаноле для приготовления растворов каждого соединения в концентрации 50 мкг на миллилитр.
Центрифугируйте при 13, 500 раз g в течение 10 минут и соберите ингредиенты для анализа ЖХ-МС/МС. Используйте ту же программу градиентного элюирования, что и в анализе ВЭЖХ, для анализа ЖХ-МС с объемом впрыска пять микролитров. Характеристика промежуточного продукта реакции с ЯМР.
Часть очищенных промежуточных продуктов реакции дайдзина растворить в диметилсульфоксид-дейтерированной шестерке для ЯМР-спектроскопии протона и углерода 13. Запишите спектры ЯМР на ЯМР-приборе с частотой 400 мегагерц для протона. Запишите спектры ЯМР на ЯМР-приборе с частотой 175 МГц для углерода-13.
Репрезентативные результаты. В целом, мы разработали комбинированный экспериментальный подход, который включает в себя производство и очистку белка, эксперименты по кристаллизации, анализ активности и идентификацию структур продуктов реакции на рисунке 1. В частности, мы получили белки высокой чистоты с помощью трехступенчатой очистительной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-фильтрационной хроматографии на рисунке 2.
В экспериментах по кристаллизации мы определили кристаллические структуры DgpA и комплекса DgpB/C с разрешением 2,7 ангстрема и 2,1 ангстрема соответственно на рисунках 3A - D. Мы также обнаружили, что DgpA принимает автоингибированное подтверждение в своей гексамерной форме на рисунках 3B и C, что было подтверждено с помощью анализа восстановления DCPIP на рисунке 3F. Далее мы обнаружили, что глюкоза образует сеть водородных связей с ключевыми аминокислотами в кармане распознавания субстрата DgpA на рисунке 3E. Основываясь на этом, мы сконструировали мутантов и оценили их активность расщепления субстрата с использованием кинетических параметров, показанных на рисунке 3J.
Интересно, что во время расщепления О-гликозидных флавоноидов и DgpA/B/C мы наблюдали образование промежуточных соединений на рисунках 4А и В. Эти промежуточные продукты были идентифицированы как С-гликозидные флавоноиды с помощью анализа ЯМР и ЛХ-МС на рисунках 4С-Н, что указывает на то, что DgpA/B/C может превращать О-гликозиды в С-гликозиды. Мы первыми объединили химию и биотехнологию для изучения структуры и функциональных характеристик ферментов метаболизма С-гликозидов, продемонстрировав, что это разумное и практичное решение. Этот подход заполняет пробелы в методологиях исследований в этой области и может быть легко применен к другим генам с другими метаболическими функциями.
Таким образом, он также предоставляет новую эталонную модель для будущих исследований структурных и функциональных характеристик других микробных функциональных белков кишечника.
