Наш протокол имеет важное значение, потому что он может быть использован для воспроизведения создать мышей как с микробиомом кишечника человека и иммунной системы человека. Мы называем этих мышей двойными гуманизированными мышами. Двойная гуманизированная модель мыши может быть использована как для фундаментальных, так и для трансляционных биомедицинских исследований, включая изучение виво-отношений между микробиомом кишечника человека и иммунной системой человека.
Демонстрация процедуры будет Jianshui Чжан, postdoc, и Yilun Чанг, аспирант из нашей лаборатории. Чтобы имплантировать ткани печени и тимуса в капсулу левой почки, сначала поместите мышь в капюшон. В день операции, лечить мышей с субаретального облучения всего тела на 12 centigrays на грамм дозы массы тела.
Бритье каждой мыши вокруг левой боковой и медиальной стороны после подтверждения соответствующего уровня sedation. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного и при необходимости нанесите ушную бирку. Дезинфицировать кожу тремя последовательными йодом и 70%изопропанол скрабами.
Когда кожа была подготовлена, используйте типсы для загрузки от одного до одного до шести миллиметров кубичный фрагмент ткани печени плода человека в трокар, а затем один-к-1,6 миллиметра кубированного человеческого плода фрагмент ткани тимуса плода. Используйте типсы, чтобы поднять кожу, и использовать скальпель, чтобы сделать небольшой продольный нарезать кожу. Расширьте разрез до 1,5-2 сантиметров с левой стороны мыши.
И использовать типсы, чтобы поднять мышечный слой. Используйте ножницы, чтобы открыть мышечный слой продольно, расширяя разрез по мере необходимости, чтобы разоблачить почки, и осторожно понять жировой ткани, окружающие почки. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез от одного до двух миллиметров в задней части капсулы почки и медленно вставить предварительно загруженный трокар в разрез параллельно длинной оси почки.
Отпустите ткани между капсулой почки и почками, и верните почки и кишечник в нормальное положение. Затем используйте швы, чтобы закрыть мышечный слой и хирургические скобы, чтобы закрыть кожу. Поместите мышь в автоклавную клетку микроизолатора с мониторингом до полной лежачих.
Через шесть часов после операции поместите мышей под тепловую лампу и дезинфицировать хвосты 70%изопропанолом. Инъекции от 1,5 до 5 раз от 10 до пяти CD34 положительные ткани печени плода человека изолированных гемопоитических стволовых клеток в 200 микролитров PBS в один расширенный хвост вены на животное. Затем остановить кровотечение с нежным давлением и вернуть мышей в свою домашнюю клетку.
Девять-12 недель после операции, использовать соответствующий размер пластиковый гребень сдержанность, чтобы изолировать одну ногу одной гуманизированной мыши, и спрей медиальной стороне изолированной ноги с 70%изопропанол. Распространение антибиотиков и обезболивающих мази на сайте сбора. Используя 25-го калибра иглы, состоявшейся под углом 90 градусов, проколоть сафенозную вену, чтобы собрать от 50 до 100 микролитров крови в трубку сбора крови с покрытием ЭДТА.
Когда подходящий объем крови был получен, применять давление на сайт с стерильным куском марли, чтобы остановить кровотечение, прежде чем вернуть мышь в клетку. Затем используйте собранный образец периферической крови для оценки уровня восстановления иммунных клеток человека путем цитометрии потока с использованием антител против человека CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 и мыши CD45. Для сбора свежих фекальных образцов поместите отдельные автоклавные бумажные пакеты в капот дыма и поместите по одной мыши в каждый мешок до тех пор, пока каждое животное не испражняется.
Затем верните мышей в клетку и используйте стерильные типсы для передачи каждого фекального образца в одну 1,5-миллилитровую трубку на мышь при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В конце 14-дневного лечения антибиотиками, изменить питьевую воду на автоклав стерилизованную воду, и передать мышей в новую автоклавную клетку. Через 24 и 48 часов после прекращения антибиотиков оттепель должным образом подготовлены источники фекальной микробиоты трансплантации материала, и aliquot образцы в анаэробной камере в анаэробных условиях.
Для выполнения фекальной трансплантации доставаем 200 микролитров фекального материала для пересадки микробиоты через пероральный гаваж каждому экспериментальному животному и распространяем любой оставшийся талый материал на мех гуманизированных мышей или на постельные принадлежности клетки. Здесь показан пример цитометрического анализа потока периферической крови с гуманизированной мыши BLT через 10 недель после операции. Популяции Т и В клеток могут быть идентифицированы, а также подмножества положительных Т-клеток CD4 и CD8.
На этом графике наблюдается относительное изобилие образцов фекальных доноров человека, используемых для переноса микрофлоры кишечника для создания двойных гуманизированных мышей. Фенотипические изменения селезенки и cecum, вызванные лечением антибиотиками, аналогичны тем, которые наблюдаются у животных, свободных от микробов. Этот основной участок анализа компонентов репрезентативных данных секвенирования рибосомной РНК 16S показывает, что двойные гуманизированные мыши имеют микробиомы кишечника, похожие на человека, которые являются уникальными для образца донора человека.
Наиболее важным аспектом этого протокола является ограничение введения нежелательных бактерий для обеспечения мышей оставаться здоровыми и поддерживать микрофлору кишечника человека. Эта модель имеет потенциал для продвижения персонализированной медицины и позволить нам взглянуть на то, как болезнь человека влияет на микрофлору кишечника, контролируя при этом другие смягчающие факторы.
