Нейтрофилы являются терминально дифференцированными клетками, и в настоящее время нет клеточных линий, чтобы полностью рекапитулировать биологию нейтрофилов. При этом необходимо получать чистые, инактивированные, здоровые и свежие нейтрофилы для изучения их биологии. Этот метод обновления сочетает в себе градиент плотности, осаждение, щадящий лизис для получения чистого нейтрофильного препарата.
Он прост в настройке, требует простого оборудования и небольшой практики. Технический аспект, такой как градиентное наслоение, этого метода потребует некоторой практики для освоения, но как только градиент будет усовершенствован, другие шаги должны быть легкими. Начните со стерилизации пальто, упаковки и ламинарного капюшона.
Затем добавьте 10 миллилитров крови в 50-миллилитровую трубку. Чтобы разбавить кровь для очистки градиента, добавьте 5% FBS/HBSS и восполняйте объем до 35 миллилитров. После закрытия крышки переверняйте трубку несколько раз для перемешивания, а затем держите трубку вверх ногами, чтобы получить дно, лишенное эритроцитов.
Добавьте 10 миллилитров среды градиента плотности непосредственно под кровью, гарантируя, что среда и кровь не смешиваются, а интерфейс остается острым. Вращайте трубку в 400 раз в течение 30 минут при комнатной температуре, обязательно отключая тормоз. После вращения наблюдают градиент, разделенный на верхний слой плазмы сыворотки, среднее белое кольцо мононуклеарных клеток периферической крови, мутный средний слой градиента плотности и нижнюю гранулу, состоящую из белой тонкой нейтрофильной полосы поверх красных кровяных телец.
Чтобы удалить PBMC, выйдите всасывающая пипетка непосредственно в слой PBMC и полностью аспирировать, в то время как слой плазмы сыворотки уменьшается по мере удаления кольца. Соскоблите боковую часть трубки всасывающим пипеткой, чтобы максимизировать удаление PBMC. Осторожно удалите слой мутной среды градиента плотности между кольцом PBMC и гранулой нейтрофила/эритроцита.
Для оседания эритроцитов используйте пипетку 10 миллилитров для переноса гранул нейтрофила / эритроцита в чистую трубку. Затем добавьте 5% FBS/HBSS к конечному объему 25 миллилитров. Непосредственно добавьте в пробирку 25 миллилитров предварительного раствора, содержащего 3% декстрана/0,9% NaCl в воде и осторожно перемешайте путем инверсии.
Поместите трубку на выровневую и невибрируемую поверхность на 15 минут. Поместив трубку обратно в вытяжку, слегка погрузите пипетку в жидкость и соберите примерно 30 миллилитров верхнего слоя, следуя за поверхностью жидкости вниз. Вращайте трубку, чтобы получить красную гранулу без плавающих частиц в среде.
Для лизиса остаточного эрицита осторожно аспирировать супернатант, не нарушая гранулу. Добавьте 25 миллиметров стерильной сверхчистой воды непосредственно в трубку и осторожно перемешайте, перевернив трубку в течение 28 секунд, чтобы лизеть эриурецит. Затем сразу же добавляют в пробирку 25 миллилитров стерильного 1,8% раствора NaCl, приготовленного в воде, и доводят раствор обратно в изотонические условия путем бережного перемешивания.
Вращайте трубку в 200 раз в течение трех-пяти минут с низким тормозом, чтобы свести к минимуму осаждение эритроцитов и тромбоцитов с нейтрофилами. Для повторного усыпширования гранулы белого нейтрофила непосредственно добавьте питательную среду на гранулу, но не пипетку вверх и вниз. Затем раскачиваем трубку горизонтально из стороны в сторону, чтобы свести к минимуму активацию клеток.
Если наблюдается агрегация или слипание клеток, отфильтруйте клеточную суспензию через 70-микрометровую сетку, чтобы отбросить слипшиеся нейтрофилы. Для оценки качества выделенного нейтрофильного препарата окрашивают клетки маркерами, специфичными для нейтрофилов, эозинофилов, и маркером активации. После получения 20 000 клеток методом проточной цитометрии, проанализируйте чистоту и активацию клеток с использованием стратегий гастика и определите жизнеспособность клеток с использованием Annexin V/propidium iodide, как описано в текстовой рукописи.
Градиент плотности с низкой скоростью давал нейтрофилы с большей чистотой, в то время как высокая скорость приводила к увеличению урожайности за счет чистоты. Используя флуоресцентно-активированную сортировку клеток, только распределение клеток обеспечивало оценку качества изоляции клеток, но следует отдавать предпочтение использованию специфических клеточных маркеров. Идентифицированные популяции загрязняющих клеток были моноцитами, лимфоцитами и эозинофилами.
Огромный выход нейтрофилов был достигнут с помощью этого протокола. Оценивалась экспрессия CD62L. Средняя интенсивность флуоресцентности для CD62L была снижена в положительных контрольных клетках, что указывает на выбрасывание CD62L и активацию нейтрофилов.
Здоровье нейтрофилов должно быть оценено перед выполнением анализа, поскольку нейтрофилы имеют относительно короткий период полувысок, а активация еще больше сокращает жизнь. После очистки нейтрофилов с использованием градиента плотности и коммерческих микрошипов клетки культивировали в течение 24 часов, а выживаемость клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. Количественная оценка жизнеспособных клеток показала, что очистка градиента плотности привела к более жизнеспособным клеткам через 24 часа, чем очистка с использованием набора.
Важно, чтобы этапы градиентного наслоения и центрифугирования выполнялись как можно лучше, так как это сильно повлияет на качество препарата. Эксперименты in vitro и биохимические анализы могут быть выполнены после этой процедуры. Кроме того, отрицательный отбор может быть выполнен, если требуются сверхчистые клетки, как в экспериментах по экспрессии цитокинов и белков.
