Этот протокол позволяет исследователям наблюдать, как С-элганы реагируют на агонист рецепторов ацетилхолина Левамизол. Измененная чувствительность левамизола может указывать на дефекты передачи сигналов в их нервно-мышечном соединении или мышечной функции. Основным преимуществом является то, что энергичное плавание C-elgans в растворе Levamisole позволяет исследователям количественно оценить зависящий от времени паралич сотен червей всего за один час.
Подсчет количества червей в каждой лунке каждые пять минут может быть ошеломляющим. Количество проанализированных скважин или временные точки могут быть скорректированы при необходимости. Для начала приготовления среды роста нематоды соедините три грамма хлорида натрия, 2,5 грамма пептона и 17 граммов агара с одним литром деионизированной воды в колбе с перемешивающим батончиком.
После автоклавирования положите носитель на конфорку, установленную на 70 градусов Цельсия, и перемешивайте с умеренной скоростью в течение одного часа. Добавьте один миллилитр пяти миллиграммов на миллилитр холестерина по каплям, чтобы предотвратить осаждение. Один миллилитр одного молярного хлорида кальция, один миллилитр одного молярного сульфата магния и 25 миллилитров одного молярного буфера рН 6,0 калияфосфата в среду.
Перенесите два миллилитра среды роста нематод в каждую лунку 24-луночной пластины стерильной серологической пипеткой. Дайте тарелкам высохнуть на столешнице в течение двух дней перед посадкой с бактериями. Выберите одну колонию op 50 в бульон B и установите культуру встряхивание при 37 градусах Цельсия в течение ночи.
Используя стерильную пипетку, капните 30 микролитров суспензии OP50 на агар в середине каждой лунки. дайте тарелкам постоять при комнатной температуре в течение не менее двух дней после сидения, чтобы сформировать бактериальный газон. Выращивают дикие типы unc-63 Lev10 и unc-49 C-elgan до зрелого возраста на шестисантиметровых пластинах, готовя не менее восьми пластин на штамм.
Приготовьте отбеливающий раствор под капотом в день синхронизации. Смешайте 10 миллилитров отбеливателя, 2,5 миллилитра гидроксида натрия и 37,5 миллилитров деионизированной воды в 50-миллилитровой летописной трубке. С помощью пластиковой переносной пипетки смойте гравидных взрослых червей по меньшей мере с четырех пластин с буфером М9 и переложите их в 15-миллилитровую хроникальную трубку.
Вращайте 716 G в течение одной минуты при комнатной температуре, а затем извлеките супер натант с помощью передаточной пипетки. Добавить 10 миллилитров отбеливающего раствора. Осторожно встряхните трубку в течение четырех минут, пока большинство, но не все туши червей растворятся.
Вращайтесь при 716 G в течение одной минуты. Вылейте раствор отбеливателя одним движением. До тех пор, пока трубка не будет встряхнута в этот момент, яйца будут прилипать к боковой части трубки на 15 миллилитрах буфера M9 и инвертироваться.
Вращайтесь при 716 G в течение одной минуты и выливайте буфер M9 одним плавным движением. Повторите эту промывку буферным раствором три раза. После окончательной промывки добавьте 10 миллилитров свежего M9 и поместите на ротатор на ночь при 15 градусах Цельсия, чтобы изолировать синхронизированную популяцию голодающих животных первой личиночной стадии.
Распечатайте на 24 лунку пластины и назначьте деформации в рандомизированные места. Примерно через 24 часа после приготовления отбеливателя отбеливатели вылупившиеся голодные черви L1 при 716 g в течение одной минуты при комнатной температуре. Удалите примерно девять миллилитров буфера M9 с помощью пластиковой переносной пипетки, а затем осторожно перемешайте голодающих червей первой личиночной стадии в оставшемся буфере M9.
Сразу же выложите три микролитра червей и буфера М9 на предметное стекло микроскопа и определите количество L1. Желаемое число составляет от 20 до 30 L1 в трех микролитрах. Пипетка три микролитра L1 в каждую скважину в соответствии с предварительно составленной картой пластин, пусть черви вырастут до взрослой жизни в течение трех дней при 20 градусах Цельсия.
Распечатайте чистый лист данных, который будет использоваться для записи количества червей, движущихся в каждой скважине каждые пять минут в течение одного часа. Проверьте червей в 24 плитах скважины. Используя маркер, сделайте X на крышке пластины над любыми скважинами, которые имеют загрязнение, голодают или имеют слишком много червей, что затруднит подсчет.
Делают 0,4 миллимоляра раствора левамизола, добавляя 200 микролитров 100 миллимолярного запаса левамизола к 50 миллилитрам М9. Запустите таймер, а затем с помощью передаточной пипетки добавьте один миллилитр 0,4 миллимолара левамизола в первые две лунки, чтобы животные свободно плавали. Продолжайте добавлять Levamisole к соседним скважинам, ошеломляя время в соответствии с количеством скважин, подлежащих анализу. Через пять минут начните вручную подсчитывать только количество движущихся червей в каждой скважине, начиная с первой скважины, и запишите это число в техническом паспорте.
Продолжайте подсчитывать количество движущихся червей в каждой скважине каждые пять минут в течение одного часа. В конце анализа или когда позволяет время, запишите общее количество червей в каждой скважине. Получите пластину, отметьте и запишите, какая деформация соответствует каждой скважине.
Введите данные в электронную таблицу, начиная с общего количества червей в каждой скважине и организуя по генотипу. Объединив данные из скважин, определите количество червей, движущихся в каждой точке времени. Используйте это для вычисления числа, которое парализуется в каждый момент времени.
Сделайте таблицу данных такой, чтобы в левом столбце указывалось время, а последующие столбцы содержали данные для каждого штамма. Для каждого животного, которое парализовано в течение первых пяти минут, создайте ряд и введите один на пять минут. Повторите это для каждой точки времени.
Для всех животных, которые не парализуются к концу анализа, введите ноль на 60 минут. Используйте эти данные для создания кривой выживания в конкретном статистическом программном обеспечении, используемом здесь для визуального отображения зависящего от времени паралича популяции. Данные по всем анализируемым штаммам должны быть введены в одну и ту же таблицу данных, оставляя пробелы по мере необходимости.
Мутации в субъединицах рецептора левамизола ацетилхолина, а также в генах, необходимых для кластеризации постсинаптических левамизол-чувствительных ацетилхолиновых рецепторов, вызывают устойчивость к параличу, вызванному левамизолом, как это наблюдалось у мутантов unc-63 и Lev-10 соответственно. Потеря ГАМК-закрытого ионного канала unc-49 вызывала гиперчувствительность левамизола из-за нарушения правильного баланса холинергической и ГАМкергической сигнализации. Необходима правильная подготовка 24 плит скважины.
Если бактериальные газоны не высохли до обнаружения L1, раствор левамизола может стать мутным во время анализа, что препятствует наблюдению. Модифицируя 24 пластины скважины, этот протокол может быть выполнен с RNAi сбитыми животными. Это позволяет исследователям изучать гены C-elgan, для которых мутанты недоступны.
