Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

Resumen

Este protocolo describe un método de tres dimensiones escala micrométrica imágenes de la concentración de oxígeno en el entorno inmediato de las células vivas por microscopía electrónica de resonancia de spin.

Resumen

Este protocolo describe una resonancia de spin electrónico (ESR) micro-método para imágenes tridimensionales de mapeo de los niveles de oxígeno en el entorno inmediato de las células vivas con una resolución de escala micrométrica ^1. El oxígeno es una de las moléculas más importantes en el ciclo de vida. Que sirve como receptor terminal de electrones de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias y se utiliza en la producción de especies reactivas del oxígeno. Las mediciones de oxígeno son importantes para el estudio de las funciones mitocondriales y metabólicos, vías de señalización, los efectos de los diversos estímulos, permeabilidad de la membrana, y la diferenciación de la enfermedad. El consumo de oxígeno es por lo tanto, un marcador informativo del metabolismo celular, que es ampliamente aplicable a diferentes sistemas biológicos de las mitocondrias en las células de organismos completos. Debido a su importancia, muchos métodos han sido desarrollados para las mediciones de oxígeno en los sistemas vivos. Los intentos actuales para proporcionar imágenes de alta resolución de oxígeno se basan principalmente en la fluorescencia óptica y los métodos de fosforescencia que no ofrecen resultados satisfactorios, ya que emplean sondas con fotografías de alta toxicidad y sensibilidad con poco oxígeno. ESR, que mide la señal de las sondas paramagnéticas exógenos en la muestra, es conocida por proporcionar mediciones muy precisas de la concentración de oxígeno. En un caso típico, las mediciones de ESR mapa LineShape ampliación de la sonda y / o relajación, acortando el tiempo que están vinculados directamente a la concentración de oxígeno local. (El oxígeno es paramagnética, por lo tanto, al chocar con la sonda paramagnética exógenos, que falta de su tiempo de relajación.) Tradicionalmente, este tipo de experimentos se llevan a cabo con una resolución baja, a escala milimétrica ESR para obtener imágenes de pequeños animales. Aquí mostramos como ESR imágenes también se pueden realizar en la escala micrométrica para el examen de las pequeñas muestras vivas. ESR micro-imagen es una metodología relativamente nueva que permite la adquisición de resolver espacialmente las señales de ESR con una resolución de 1 micra acercarse a temperatura ambiente ^2. El principal objetivo de este protocolo de papel es mostrar cómo este nuevo método, junto con el nuevo desarrollo sensibles al oxígeno, sondas, se puede aplicar a la cartografía de los niveles de oxígeno en pequeñas muestras vivas. Una resolución espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 m se demuestra, con casi micromolar sensibilidad concentración de oxígeno y sub-femtomol sensibilidad absoluta de oxígeno por voxel. El uso de ESR micro-imágenes para el mapeo de oxígeno cerca de las células complementa las técnicas disponibles actualmente sobre la base de micro-electrodos o de fluorescencia / fosforescencia. Además, con la sonda paramagnética adecuada, sino que también será de fácil aplicación para intracelular de oxígeno micro-imagen, una capacidad que otros métodos resulta muy difícil de lograr.

Protocolo

1. Resumen de ESR Micro-imágenes

En primer lugar, ofrecemos una breve explicación de ESR, microscopía de ESR, y los diversos componentes de nuestro sistema, a continuación, se describirán los experimentos de imagen real.

Resonancia de spin electrónico es una técnica espectroscópica en la que se absorbe la radiación electromagnética a una frecuencia específica de moléculas con espines de los electrones no apareados, bajo un campo magnético estático externo (Figura 1). ESR se emplea en grandes áreas de la ciencia, como la química, la biología, la física y la ciencia de materiales, para la detección e identificación de los radicales libres y centros paramagnéticos. Es un poderoso método para estudiar el medio ambiente de las moléculas paramagnéticas en especies vivas y proporciona información sobre la acidez (pH), la viscosidad, el oxígeno y las concentraciones de especies reactivas de oxígeno ^3.

Para muestras heterogéneas, la información espectral ESR se puede obtener de una manera resuelta espacialmente (es decir, mediante la obtención de una imagen), a través del uso de gradientes de campo magnético ^4. Esto es muy similar al método más común de la resonancia magnética (MRI), que observa principalmente spins de protón. Hasta ahora, las técnicas de imagen como ESR se aplicaron para especímenes vivos de tamaño relativamente grande de unos pocos centímetros y milímetros escala de resolución. (Por ejemplo, véase la figura 2, tomada de referencia 5.) Un desarrollo relativamente reciente de la VSG imagen es la ampliación de su capacidad de mirar a los animales pequeños en escala milimétrica resolución de las mediciones de las muestras milimétricas y submilimétricas tamaño con escala micrométrica resolución. Este campo se conoce como microscopio de ESR, que hoy puede ofrecer imágenes 3D ESR con una resolución de acercarse a 1 micra ² (ver ejemplos representativos en la Figura 3).

Un microscopio de ESR es esencialmente similar a un espectrómetro de ESR convencionales. Tiene un imán para generar el campo estático, un sistema de microondas para la excitación de giro y la detección de señales, una sonda para la celebración de la muestra, y una consola computarizada para controlar el proceso de adquisición y manejo de datos. Otros componentes únicos de la imagen de ESR en general y también existente en microscopia ESR son magnéticos fuentes de gradiente de campo, que forman parte del sistema electrónico, y bobinas de gradiente que se encuentran en la sonda de imagen. Más detalles sobre nuestro sistema específico se muestran en la película y el protocolo descrito en la referencia 2.

2. ESR Micro-Preparación de la muestra de imágenes

Esta etapa se describe el método para la preparación de muestras para la velocidad de sedimentación globular de micro-imágenes experimento. Al final de esta etapa las células se colocan en el fondo de un recipiente de vidrio especialmente preparadas ESR muestra de microscopio con una solución radical tritilo tampón ^6. Este protocolo describe la medición de las células de cianobacterias y, por tanto, para otros tipos de células, los ajustes adecuados puede ser necesaria en la etapa de preparación de la muestra.

1. En primer lugar, algunos cuadrados de papel absorbente con un tamaño de ~ 400 400 micras se toman y se inserta en un tubo Eppendorf que posteriormente se llena con 1,2 ml de la suspensión de las cianobacterias (en una concentración de 40 mg / ml).
2. La suspensión se centrifuga durante 2 minutos a 6000 rpm en una microcentrífuga.
3. A continuación, el búfer de sobrenadante se elimina por completo a excepción de ~ 50 l que se dejan para evitar la deshidratación cianobacterias. Como resultado de este proceso, el papel absorbente está saturado por las células de cianobacterias.
4. Con unas pinzas finas, algunas fibras se extraen de la de papel y se coloca en el fondo de una taza-como titular de la muestra preparada especialmente de vidrio ^7. Después de que un 3 mm de tritilo de BG-11 una solución ^{8, 9} (ver Esquema 1) se añade el soporte de muestras con la ayuda de una jeringa bien. El titular se sella con pegamento curable UV, dejando una pequeña salida de aire abierto.
   

   Archivo 4	Stock 3	Stock 2	Stock 1
   H 3 BO 3 2.86g/liter	K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter	MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter	Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter
   MnCl2: 4H 2 O 1.81g/liter			Citrato férrico amónico 0.6g/liter
   ZnSO4: 7H 2 O 0.222g/liter			El ácido cítrico: 1H2O 0.6g/liter
   CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter			CaCl2: 2H 2 O 3.6g/liter
   COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter
   NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter

   
   Esquema 1. Preparación de BG-11 medianas.

3. ESR Micro-imágenes de los experimentos

1. Para comenzar con el experimento de imágenes, a su vez en la velocidad de sedimentación globular de micro-sistema de imágenes e insertar la muestra en el resonador que va dentro de la sonda de imagen.
2. Ahora, usando el software de control por ordenador, configure el sistema en "Tune" y el modo de encontrar la frecuencia de resonancia de microondas de la sonda, que será utilizado para las mediciones de ESR.
3. A continuación, establezca el campo magnético estático en el valor que coincide con la frecuencia de microondas aplicada, establecer los parámetros de tiempo de la secuencia de pulsos y observar la señal de ESR para asegurarse de que el sistema funciona bien y la muestra está bien preparado.
4. A continuación, establezca los parámetros de imagen, tales como el número de píxeles, la fuerza de los gradientes, y la duración de los pulsos de gradiente a sus valores requeridos.
5. Después de la instalación, conseguir tres imágenes 3D ESR por una secuencia de eco de Hahn imagen de pulso (Figura 4) con una separación entre impulsos, los valores de  500, 600 y 700 ns.
6. La luz proyectada en la muestra se activa o desactiva en función de las condiciones experimentales necesarias.
7. Durante la adquisición, los datos se guardan automáticamente. Archivos de datos en bruto tesis se procesan a través de scripts de software Matlab para proporcionar imágenes de la concentración de tritilo radical y el tiempo de relajación T ₂ del mapa, que se traduce en una imagen de la concentración de oxígeno a través de pre-existentes de calibración.

4. Resultados representante

Los resultados del experimento son varias tridimensional ESR micro-imágenes grabadas en diferentes valores de τ. Típicas imágenes de los datos en bruto se proporcionan en la figura 5. Los tres mejores imágenes, medido bajo condiciones de oscuridad, son muy similares, excepto por la reducción en la intensidad de la señal. Por otro lado, el patrón cambia la imagen a la radiación de la luz debido a los tiempos de relajación en diferentes partes de la muestra. Estos datos se pueden procesar de ¹ a obtener una imagen de amplitud, como se muestra en la Figura 6 y también las imágenes del tiempo de relajación, T ₂ (Figura 7). La T ₂ imágenes se traducen en valores de concentración de oxígeno a través de una curva de calibración pre-existente que une a la concentración de oxígeno en el tiempo de relajación a través de la ecuación:

Aquí, T ₂ ⁰ es el tiempo de relajación spin-spin de la sonda en condiciones de anoxia (dependiendo de la concentración de la sonda, C, y su coeficiente de difusión, D), y k es una constante de proporcionalidad. En la mayoría de los casos, el coeficiente de difusión no varía mucho de las muestras en vivo (aunque, si es necesario, puede, en principio, ser directamente evaluadas también por ESR ^{6, 10),} y la concentración de giro se obtiene durante el proceso de imágenes. Por lo tanto, esta relación se puede utilizar para medir directamente la concentración de oxígeno.

Volviendo a la Figura 6, es evidente de la imagen de la amplitud que las células de cianobacterias se localizaron principalmente en el lado derecho del titular de la muestra. Por otra parte, sobre la base de la figura 7, está claro que la luz se inicia la producción de O ₂ y causa un aumento significativo en la solución de O ₂ de la concentración, sobre todo en los voxels cerca de las cianobacterias.

Figura 1: Los niveles de energía de resonancia de spin electrónico.

Figura 2: imagen típica de la concentración de oxígeno de un ratón con tumores. La imagen de la izquierda muestra la información anatómica, basada en una imagen de resonancia magnética. Un radical libre estable orgánica se inyectó a los ratones y sus características ESR proporcionan la concentración de oxígeno en su entorno (derecha). ESR-basada en los resultados se superponen a la imagen anatómica MRI. Campo de visión es de 32 mm.

Figura 3: Dos ejemplos de alta resolución de micro-escala ESR imágenes de la muestra photolithographically generado con N @ C ₆₀ en polvo (izquierda) y los cristales CFIG paramagnético (derecha)

Figura 4: Típica Hahn imágenes que muestran la secuencia de pulsos de microondas (MW) y el gradiente, G _{x, y} G y G _z pulsos.

Figura 5: Típica de datos sin ESR micro-imágenes: a, b, c son los datos en bruto de la muestra cianobacteria sin iluminación de la luz medida para τ = 500600700 ns, respectivamente. Los literales d, e, y son las mismas que a, b, c, pero con una iluminación de luz. La intensidad se representan en la escala arbitraria (pero es consistente dentro de cada conjunto de tres imágenes en bruto oscuras o claras de datos)

Figura 6: la imagen de amplitud correspondiente a la concentración de radicales en la solución (escala arbitraria).

Figura 7: T ₂ imágenes y el correspondiente [O _2] Los valores en negro (izquierda) y luz (derecha) las condiciones.

Discusión

Este protocolo muestra cómo ESR micro-imagen se pueden aplicar a la concentración de oxígeno del mapa cerca de vivir pequeñas muestras. Una resolución espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 m se demuestra, con casi micromolar sensibilidad concentración de oxígeno y sub-femtomol sensibilidad absoluta de oxígeno por voxel. El uso de ESR micro-imágenes para el mapeo de oxígeno cerca de las células complementa las técnicas disponibles actualmente sobre la base de micro-electrodos o de fluorescencia / fosforescencia. Además, con la sonda paramagnética adecuada, será de fácil aplicación para intracelular de oxígeno micro-imagen, una capacidad que otros métodos resulta muy difícil de lograr. En un futuro próximo tenemos la intención de mejorar aún más esta metodología para ofrecer imágenes en directo de la muestra con una resolución de unos pocos micrones, proporciona parámetros de contraste, tales como la concentración de superóxido, la acidez (pH), el coeficiente de difusión de la sonda y, por supuesto, la concentración de oxígeno. Estas funciones son complementarias a las actuales metodologías basadas en la óptica, tanto en términos de tipo de cambio y también de las características de las muestras (por ejemplo, la falta de transparencia muestras de espesor y, en algunos casos, las mediciones intracelulares vs extracelular).

Materiales

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge		Kendro	Heraus, 75003235
Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical		Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.
BG-11 buffer		For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.
Syringe		Hamilton	Microliter 7000.5
Ultraviolet Curing		Norland Products, Inc.	NOA63, or NOA61.