Electron Spin Resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per micron scala imaging tridimensionale della concentrazione di ossigeno nelle immediate vicinanze di cellule vive con la microscopia elettronica risonanza di spin.

Abstract

Questo protocollo descrive una risonanza di spin elettronico (ESR) micro-imaging metodo per la mappatura tridimensionale dei livelli di ossigeno nelle immediate vicinanze di cellule vive con risoluzione micron scala ^1. L'ossigeno è una delle molecole più importanti nel ciclo della vita. Serve come accettore terminale di elettroni della fosforilazione ossidativa nei mitocondri ed è usato nella produzione di specie reattive dell'ossigeno. Misure di ossigeno sono importanti per lo studio delle funzioni mitocondriali e metaboliche, vie di segnalazione, gli effetti di vari stimoli, permeabilità della membrana, e la differenziazione della malattia. Il consumo di ossigeno è quindi un marcatore informativo del metabolismo cellulare, che è ampiamente applicabile ai vari sistemi biologici dai mitocondri alle cellule di organismi interi. Per la sua importanza, molti metodi sono stati sviluppati per le misure di ossigeno in sistemi live. Attuali tentativi di fornire immagini ad alta risoluzione di ossigeno si basano principalmente sulla fluorescenza ottica e metodi di fosforescenza che non riescono a fornire risultati soddisfacenti in quanto utilizzano sonde ad alta foto-tossicità e la sensibilità di ossigeno. ESR, che misura il segnale dalle sonde paramagnetiche esogeni nel campione, è nota per fornire misurazioni molto accurate della concentrazione di ossigeno. In un caso tipico, le misure ESR mappa LineShape ampliamento della sonda e / o di rilassamento tempo accorciamento che sono collegati direttamente alla concentrazione di ossigeno locale. (L'ossigeno è paramagnetico, quindi, in caso di collisione con la sonda paramagnetica esogeni, è la sua brevità tempi di rilassamento.) Tradizionalmente, questo tipo di esperimenti siano condotti a bassa risoluzione, scala millimetrica ESR per l'imaging piccoli animali. Qui mostriamo come ESR immagini possono anche essere effettuata nel micron scala per l'esame di piccoli campioni dal vivo. ESR micro-imaging è una metodologia relativamente nuova che consente l'acquisizione di spazialmente risolta segnali ESR con una risoluzione di 1 micron si avvicina a temperatura ambiente ^2. L'obiettivo principale di questo protocollo-paper è quello di mostrare come questo nuovo metodo, insieme con nuova concezione sensibili all'ossigeno sonde, può essere applicato alla mappatura dei livelli di ossigeno in piccoli campioni dal vivo. Una risoluzione spaziale di circa 30 x 30 x 100 micron è dimostrato, con quasi micromolari sensibilità concentrazione di ossigeno e sub-femtomole sensibilità ossigeno assoluto per voxel. L'uso di ESR micro-imaging per la mappatura di ossigeno vicino cellule integra le tecniche attualmente disponibili sulla base di micro-elettrodi o fluorescenza / fosforescenza. Inoltre, con la sonda paramagnetica corretto, sarà anche facile applicazione per intracellulare di ossigeno micro-imaging, una capacità che altri metodi trovo molto difficile da raggiungere.

Protocollo

1. Panoramica di ESR Micro-imaging

In primo luogo, forniamo una breve spiegazione di ESR, microscopia ESR, e le varie componenti del nostro sistema, e quindi verranno descritti gli esperimenti di imaging attuale.

Risonanza di spin elettronico è una tecnica spettroscopica in cui viene assorbita la radiazione elettromagnetica ad una specifica frequenza di molecole con spin di elettroni spaiati, vincolate ad un campo magnetico statico esterno (Figura 1). ESR è impiegato in ampie aree della scienza, come la chimica, la biologia, fisica e scienza dei materiali, per la rilevazione e l'identificazione dei radicali liberi e dei centri paramagnetici. Si tratta di un potente metodo per studiare l'ambiente di molecole paramagnetiche in specie dal vivo e fornisce informazioni su acidità (pH), viscosità, ossigeno, e specie reattive dell'ossigeno concentrazioni ^3.

Per i campioni eterogenei, informazioni spettrali ESR può essere ottenuto in modo risolta spazialmente (cioè, ottenendo un'immagine), attraverso l'uso di gradienti di campo magnetico ^4. Questo è molto simile al metodo più comune di risonanza magnetica (MRI) che osserva principalmente gira protone. Fino ad ora, ad esempio tecniche di imaging ESR sono state applicate per gli esemplari vivi di dimensioni relativamente grandi di pochi centimetri e in mm scala risoluzione. (Per esempio vedi figura 2, tratta dal riferimento 5.) Uno sviluppo relativamente recente della VES imaging è l'estensione delle sue capacità di guardare i piccoli animali in millimetri scala risoluzione alle misure di campioni millimetrica e sub-millimetriche dimensioni con micron scala risoluzione. Questo campo è nota come microscopia ESR, che oggi in grado di fornire immagini 3D ESR con una risoluzione avvicina 1 micron ² (vedi esempi rappresentativi in Figura 3).

Un microscopio ESR è essenzialmente simile a uno spettrometro ESR convenzionale. E 'una calamita per la generazione del campo statico, un sistema a microonde per l'eccitazione di spin e la rilevazione del segnale, una sonda per la tenuta del campione, e una console computerizzata di controllare il processo di acquisizione e gestione dei dati. Altri componenti unica l'imaging ESR in generale ed esistenti anche in ESR microcopia sono fonti di gradiente di campo magnetico, che fanno parte del sistema elettronico, e bobine di gradiente che si trovano nella sonda imaging. Maggiori dettagli sul nostro sistema specifico vengono mostrati nel film protocollo e descritti in riferimento 2.

2. ESR micro-imaging Preparazione del campione

Questa fase descrive il metodo per la preparazione dei campioni per la micro-imaging esperimento ESR. Al termine di questa fase le cellule sono immessi sul fondo di un contenitore appositamente preparato ESR campione di vetro microscopia insieme ad un radicale tritil ⁶ soluzione tampone. Questo protocollo descrive la misurazione delle cellule cianobatteri e, quindi, per altri tipi di cellule, aggiustamenti possono essere necessari in fase di preparazione del campione.

1. In primo luogo, alcune piazze di carta assorbente con una dimensione di circa 400 400 micron vengono presi ed inseriti in una provetta Eppendorf che viene successivamente riempita con 1,2 ml di sospensione cianobatteri (ad una concentrazione di 40 mg / mL).
2. La sospensione è centrifugata per 2 minuti a 6000 RPM in una microcentrifuga.
3. A seguito di questa, il buffer surnatante viene completamente rimosso tranne che per ~ 50 microlitri che sono a sinistra per evitare la disidratazione cianobatteri. Come risultato di questo processo, la carta assorbente è ormai saturo dalle cellule cianobatteri.
4. Utilizzando una pinzetta sottile, alcune fibre vengono estratte dalla carta e posto sul fondo di una coppa come porta bicchiere appositamente preparati campione ^7. Successivo a quello di 3 mm di tritil in BG-11 soluzione ^{8, 9} (vedi schema 1) viene aggiunto il supporto del campione con l'aiuto di una siringa sottile. Il titolare viene poi sigillato con colla curabili UV, lasciando una piccola presa d'aria aperta.
   

   Stock 4	Stock 3	Stock 2	Magazzino 1
   H 3 BO 3 2.86g/liter	K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter	MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter	Na 2 EDTA Mg 0.1g/liter
   MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter			Citrato ferrico di ammonio 0.6g/liter
   ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter			Acido citrico: 1H2O 0.6g/liter
   CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter			CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter
   CoCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter
   Namoo 4: 2H 2 O 0.391g/liter

   
   Schema 1. Preparazione di BG-11 di media.

3. ESR micro-imaging Esperimenti

1. Per iniziare l'esperimento di imaging, attivare la micro-sistema di imaging ESR e inserire il campione nel risonatore che va all'interno della sonda di imaging.
2. Ora, usando il software di controllo del computer, impostare il sistema in modalità "Tune" e trovare la frequenza di risonanza a microonde della sonda, che sarà utilizzato per le misurazioni ESR.
3. In seguito, impostare il campo magnetico statico sul valore che corrisponde alla frequenza delle microonde applicata, impostare i parametri di temporizzazione per la sequenza di impulsi e osservare il segnale ESR per assicurarsi che il sistema funziona bene e il campione è ben preparato.
4. Quindi, impostare i parametri di imaging, come ad esempio il numero di pixel, la forza dei gradienti, e la lunghezza degli impulsi gradiente ai valori richiesti.
5. A seguito di setup, raccogliere tre immagini 3D ESR da una sequenza eco Hahn di imaging cardiaco (Figura 4) con la separazione interpulso, i valori di  500, 600 e 700 ns.
6. Luce proiettata al campione è acceso o spento a seconda delle condizioni richieste sperimentali.
7. Durante l'acquisizione, i dati vengono salvati automaticamente. Tesi file raw dati vengono poi elaborati tramite script software Matlab per fornire immagini della concentrazione tritil radicale e il tempo di rilassamento T ₂ mappa, che si traduce in una immagine concentrazione di ossigeno tramite pre-esistente di calibrazione.

4. Rappresentante Risultati

I risultati dell'esperimento sono diversi tridimensionale ESR micro-immagini registrate a differenti valori di τ. Tipiche immagini di dati grezzi sono forniti in Figura 5. Le prime tre immagini, misurato in condizioni di oscurità, sono molto simili tranne per la riduzione dell'intensità del segnale. D'altra parte, il modello cambia immagine sotto irradiazione di luce a causa delle differenti tempi di rilassamento in diverse parti del campione. Questi dati possono essere trattati da ¹ a ottenere un'immagine di ampiezza, come mostrato in figura 6 e anche le immagini del tempo di rilassamento, T ₂ (Figura 7). T ₂ immagini sono tradotti in valori concentrazione di ossigeno attraverso un pre-esistente curva di calibrazione che collega la concentrazione di ossigeno per il tempo di rilassamento tramite l'equazione:

Qui, T ₂ ⁰ è la spin-spin tempo di rilassamento della sonda in condizioni anossiche (in funzione della concentrazione della sonda, C, e il suo coefficiente di diffusione, D), e k è una costante di proporzionalità. Nella maggior parte dei casi, il coefficiente di diffusione non varia molto per i campioni dal vivo (anche se, se necessario, può in linea di principio essere direttamente valutati anche da ESR ^{6, 10),} e la concentrazione di spin si ottiene durante il processo di imaging. Pertanto, questa relazione può essere utilizzato per misurare direttamente la concentrazione di ossigeno.

Tornando alla figura 6, è evidente dall'immagine ampiezza che le cellule cianobatteri si trovavano principalmente sul lato destro del supporto del campione. Inoltre, sulla base di Figura 7, è chiaro che la luce inizia la produzione di O ₂ e provoca un aumento significativo nella soluzione di concentrazione di O _2, principalmente nel voxel vicino al cianobatteri.

Figura 1: I livelli di energia a risonanza di spin elettronico.

Figura 2: Tipica immagine concentrazione di ossigeno di un mouse cuscinetto tumore. L'immagine a sinistra mostra le informazioni anatomiche, basata su un'immagine di risonanza magnetica. Un organico stabile radicali liberi è stata iniettata per il mouse e le sue caratteristiche ESR fornire la concentrazione di ossigeno al suo ambiente (a destra). ESR a base di risultati si sovrappongono alla risonanza magnetica immagine anatomica. Campo visivo è di 32 mm.

Figura 3: Due esempi di alta risoluzione su scala micro-ESImmagini R del campione photolithographically generati con N @ C ₆₀ in polvere (a sinistra) e cristalli paramagnetici LIPC (a destra)

Figura 4: Tipico Hahn immagine che mostra la sequenza di impulsi a microonde (MW) e di pendenza, G _{x, y} G e G _z impulsi.

Figura 5: Tipico dati grezzi ESR micro-immagini: a, b, c sono i dati grezzi del campione cianobatterio senza illuminazione luce misurata per τ = 500.600.700 ns, rispettivamente. Elementi d, e, e sono le stesse a, b, c, ma con illuminazione luce. L'intensità è tracciata in scala arbitraria (ma è coerente all'interno di ogni serie di tre immagini raw buio o luce di dati)

Figura 6: immagine di ampiezza corrispondente alla concentrazione dei radicali nella soluzione (scala arbitraria).

Figura 7: T ₂ immagini e il corrispondente [O _2] valori sotto scuro (a sinistra) e leggero (a destra) condizioni.

Discussione

Questo protocollo mostra come ESR micro-imaging può essere applicato a mappa della concentrazione di ossigeno vicino vivono piccoli campioni. Una risoluzione spaziale di circa 30 x 30 x 100 micron è dimostrato, con quasi micromolari sensibilità concentrazione di ossigeno e sub-femtomole sensibilità ossigeno assoluto per voxel. L'uso di ESR micro-imaging per la mappatura di ossigeno vicino cellule integra le tecniche attualmente disponibili sulla base di micro-elettrodi o fluorescenza / fosforescenza. Inoltre, con la sonda paramagnetica corretto, sarà di facile applicazione per intracellulare di ossigeno micro-imaging, una capacità che altri metodi trovo molto difficile da raggiungere. Nel prossimo futuro abbiamo in programma su un ulteriore miglioramento di questa metodologia di fornire immagini di esempio dal vivo con una risoluzione di pochi micron, fornendo i parametri di contrasto come la concentrazione di ossido super, l'acidità (pH), coefficiente di diffusione della sonda e, naturalmente, la concentrazione di ossigeno. Queste funzionalità sono complementari agli attuali ottici basati su metodologie sia in termini di tipo di contrasto e anche delle caratteristiche dei campioni (ad esempio, campioni di spessore non trasparente e, in alcuni casi, le misurazioni intracellulari vs extracellulare).

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge		Kendro	Heraus, 75003235
Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical		Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.
BG-11 buffer		For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.
Syringe		Hamilton	Microliter 7000.5
Ultraviolet Curing		Norland Products, Inc.	NOA63, or NOA61.