Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Mikrometer-Skala dreidimensionale Bildgebung der Sauerstoffkonzentration in der unmittelbaren Umgebung der lebenden Zellen durch Elektronen-Spin-Resonanz-Mikroskopie.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Elektron-Spin-Resonanz (ESR) Mikro-Imaging-Methode zur dreidimensionalen Abbildung von Sauerstoff in der unmittelbaren Umgebung lebende Zellen mit Mikrometer-Skala Auflösung ^1. Sauerstoff ist eines der wichtigsten Moleküle in den Kreislauf des Lebens. Es dient als terminaler Elektronenakzeptor der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien und ist in der Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies verwendet. Messungen der Sauerstoff für das Studium der Mitochondrien und Stoffwechselfunktionen, Signalwege, die Auswirkungen der verschiedenen Reize, Membranpermeabilität und Krankheit Differenzierung wichtig. Sauerstoffverbrauch ist daher eine informative Marker des zellulären Stoffwechsels, die weitgehend für die verschiedenen biologischen Systemen aus den Mitochondrien von Zellen bis zu ganzen Organismen ist. Aufgrund seiner Bedeutung ist, haben viele Methoden für die Messung von Sauerstoff in Live-Systemen entwickelt. Aktuelle Versuche, hochauflösenden Sauerstoff Bildgebung bieten sich vor allem auf optische Fluoreszenz und Phosphoreszenz Methoden, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen, wie sie Sonden mit hoher Bild-Toxizität und geringe Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff beschäftigen scheitern basiert. ESR, die das Signal vom exogenen paramagnetischen Sonden in der Probe misst, ist bekannt, dass sehr genaue Messungen der Sauerstoffkonzentration liefern. In einem typischen Fall map ESR-Messungen der Sonde Linienform Verbreiterung und / oder Entspannungs-Zeit verkürzen, die direkt an der lokalen Sauerstoffkonzentration verbunden. (Sauerstoff ist paramagnetisch; daher beim Zusammenstoß mit der exogenen paramagnetischen Sonde, Kurzatmigkeit sie ihren Relaxationszeiten.) Traditionell diese Art von Experimenten mit niedriger Auflösung, Millimeter-Skala ESR für Kleintiere Imaging durchgeführt. Hier zeigen wir, wie ESR Bildgebung kann auch in den Mikrometer-Maßstab durchgeführt werden für die Untersuchung von kleinen Live-Proben. ESR Mikro-Imaging ist eine relativ neue Methode, die den Erwerb von ortsaufgelösten ESR-Signale mit einer Auflösung von fast 1 Mikron bei Raumtemperatur ² ermöglicht. Das Hauptziel dieses Protokoll-Papier ist zu zeigen, wie diese neue Methode, zusammen mit neu entwickelten Sauerstoff-sensitive Sonden kann die Zuordnung der Sauerstoffgehalt in kleine Live-Proben angewandt werden. Eine räumliche Auflösung von ca. 30 x 30 x 100 pm nachgewiesen wird, mit nahezu mikromolaren Sauerstoffkonzentration Sensitivität und sub-Femtomol absolute Sauerstoffempfindlichkeit pro Voxel. Der Einsatz von ESR Mikro-Imaging für Sauerstoff-Mapping in der Nähe Zellen ergänzt die derzeit verfügbaren Techniken der Mikro-Elektroden oder Fluoreszenz / Phosphoreszenz basiert. Darüber hinaus mit der richtigen paramagnetischen Sonde, wird es auch leicht anwendbar für die intrazelluläre Sauerstoff-Mikro-Imaging, eine Fähigkeit, die andere Methoden finden, sehr schwer zu erreichen.

Protokoll

1. Übersicht der ESR Micro-Imaging

Erstens bieten wir eine kurze Erläuterung der ESR, ESR-Mikroskopie und die verschiedenen Komponenten unseres Systems, und dann werden wir die tatsächliche Imaging Experimente beschreiben.

Elektronen-Spin-Resonanz ist eine spektroskopische Technik, bei der elektromagnetische Strahlung bei einer bestimmten Frequenz durch Moleküle mit ungepaarten Elektronenspins absorbiert wird, platziert im Rahmen eines externen statischen Magnetfeld (Abbildung 1). ESR ist in weiten Bereichen der Wissenschaft, wie Chemie, Biologie, Physik und Materialwissenschaften beschäftigt, für die Detektion und Identifizierung von freien Radikalen und paramagnetischen Zentren. Es ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der Umgebung von paramagnetischen Molekülen in lebenden Arten und gibt Auskunft über Säuregrad (pH), Viskosität, Sauerstoff und reaktiven Sauerstoff-Spezies-Konzentrationen ^3.

Für heterogene Proben, kann ESR spektralen Informationen in ortsaufgelöst (dh durch den Erwerb eines Bildes) gewonnen werden, durch den Einsatz von Magnetfeldgradienten ^4. Dies ist sehr ähnlich zu den gängigen Verfahren der Magnetresonanztomographie (MRT), die vor allem beobachtet Protonenspins. Bis jetzt wurden solche ESR bildgebenden Verfahren für lebende Exemplare mit relativ großen Abmessungen von wenigen Zentimetern und in mm-Skala Auflösung. (Zum Beispiel siehe Abbildung 2 aus Lit. 5 entnommen.) Eine relativ neue Entwicklung in ESR-Bildgebung ist die Erweiterung seiner Fähigkeiten aus der Betrachtung Kleintiere im Millimeter-Skala Auflösung der Messungen von Millimeter-und Sub-Millimeter-Größe Proben mit Mikrometer-Skala Auflösung. Dieses Feld wird als ESR-Mikroskopie, die heute 3D-ESR Bilder mit einer Auflösung von fast 1 micron ² (siehe repräsentative Beispiele in Abbildung 3) kann liefern bekannt.

Ein ESR-Mikroskop ist im Wesentlichen ähnlich wie bei einem konventionellen ESR-Spektrometers. Es hat einen Magneten zur Erzeugung des statischen Feldes, ein Mikrowellen-System zum Spinanregung und Signalerkennung, eine Sonde zur Aufnahme der Probe, und ein EDV-Konsole auf den Erwerb Prozess-und Daten-Handling zu kontrollieren. Andere Komponenten einzigartige ESR Bildgebung im Allgemeinen und auch in bestehende ESR Mikrokopie sind Magnetfeldgradienten Quellen, die Teil des elektronischen Systems sind, und Gradientenspulen, die in der Imaging-Sonde entfernt. Weitere Details über unsere speziellen Systems sind in das Protokoll Film gezeigt und beschrieben in Referenz 2.

2. ESR Micro-Imaging Probenvorbereitung

Diese Stufe beschreibt die Methode für die Probenvorbereitung für die ESR-Mikro-Imaging Experiment. Am Ende dieser Phase-Zellen sind an der Unterseite eines speziell präparierten Glas ESR-Mikroskopie Probenbehälter zusammen mit einem Trityl-Radikals ⁶ Pufferlösung gelegt. Dieses Protokoll beschreibt die Messung von Cyanobakterien-Zellen und somit für andere Arten von Zellen, angemessene Anpassungen können in der Probenvorbereitung der Bühne benötigt werden.

1. Zuerst werden ein paar Plätze von saugfähigen Papier mit einer Größe von ~ 400 400 um entnommen und in ein Eppendorf-Röhrchen, die anschließend mit 1,2 ml der Cyanobakterien Suspension (bei einer Konzentration von 40 mg / mL) gefüllt ist.
2. Die Suspension wird für 2 Minuten bei 6000 RPM in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert.
3. Anschließend wird der Überstand Puffer vollständig außer für ~ 50 ul, die von links nach Cyanobakterien Austrocknung zu vermeiden, werden entfernt. Als Ergebnis dieses Prozesses ist die saugfähigen Papier nun durch die Cyanobakterien-Zellen gesättigt.
4. Mit feinen Pinzette, sind ein paar Fasern aus dem Papier extrahiert und auf dem Boden eines topfartigen speziell präparierten Glasprobe Halter ^7. Nach, dass eine 3 mM Trityl in BG-11-Lösung ^{8, 9} (siehe Schema 1), um den Probenhalter wird durch die Hilfe einer feinen Spritze zugegeben. Der Halter ist dann versiegelt mit UV-härtenden Klebstoff, so dass eine kleine Luftauslass zu öffnen.
   

   Lager 4	Lager 3	Lager 2	Lager 1
   H 3 BO 3 2.86g/liter	K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter	MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter	Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter
   MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter			Eisenammoniumcitrat 0.6g/liter
   ZnSO 4: 7 H 2 O 0.222g/liter			Zitronensäure: 1H2O 0.6g/liter
   CuSO 4: 5 H 2 O 0.079g/liter			CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter
   COCl 2 : 6 H 2 O 0.050g/liter
   NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter

   
   Schema 1. Vorbereitung der BG-11 Medium.

3. ESR Micro-Imaging-Experiments

1. Zu Beginn der Imaging-Experiment auf der ESR-Mikro-Imaging-System ein und legen die Probe in den Resonator, die innerhalb der Imaging-Sonde geht.
2. Jetzt, mit dem Computer-Software, stellen Sie das System auf "Tune"-Modus und finden Sie die Resonanz Mikrowellenfrequenz der Sonde, die für die ESR-Messungen verwendet werden.
3. Im Anschluss daran setzte das statische Magnetfeld auf den Wert, dass die angewandten Mikrowellenfrequenz entspricht, setzen Sie die Timing-Parameter für die Impulsfolge und beobachten Sie die ESR-Signal, um sicherzustellen, dass das System gut funktioniert und die Probe wird gut vorbereitet.
4. Dann setzen Sie die Imaging-Parameter, wie zB die Anzahl der Pixel, die Stärke des Gradienten und die Länge der Gradientenpulsen ihre geforderten Werte.
5. Nach Setup sammeln drei 3D-ESR Bilder von einem Hahn-Echo-Bildgebung Pulssequenz (Abbildung 4) mit Puls-Trennung, Werte  500, 600 und 700 ns.
6. Licht auf die Probe projiziert wird ein-oder ausschalten abhängig von der erforderlichen experimentellen Bedingungen gedreht.
7. Bei der Aufnahme werden die Daten automatisch gespeichert. Thesen Rohdaten-Dateien werden dann via Matlab Software Skript verarbeitet werden, um Bilder der Tritylradikal Konzentration und die Relaxationszeit T ₂ Karte, die in einer Sauerstoff-Konzentration image via vorbestehenden Kalibrierung übersetzt sind.

4. Repräsentative Ergebnisse

Die Ergebnisse des Experiments sind mehrere dreidimensionale ESR Mikro-Bilder mit unterschiedlichen τ-Werte aufgezeichnet. Typische Rohdaten Bilder sind in Abbildung 5 zur Verfügung gestellt. Die besten drei Bilder, unter dunklen Bedingungen gemessen, sind sehr ähnlich, außer für die Reduktion der Signalintensität. Auf der anderen Seite, das Bildmuster Veränderungen unter Bestrahlung mit Licht durch die unterschiedlichen Relaxationszeiten in verschiedenen Teilen der Probe. Diese Daten können ¹ verarbeitet werden, um eine Amplitude Bild zu erhalten, wie in Abbildung 6 gezeigt, und auch Bilder von der Relaxationszeit T ₂ (Abbildung 7). Die T ₂ Bilder werden in Sauerstoffkonzentration Werte über eine bereits vorhandene Kalibrierkurve, dass die Sauerstoffkonzentration auf die Relaxationszeit über die Gleichung Links übersetzt:

Hier ist T ₂ ⁰ der Spin-Spin-Relaxationszeit von der Sonde unter anoxischen Bedingungen (abhängig von der Sonde Konzentration, C, und die Diffusionskoeffizienten, D), und k eine Proportionalitätskonstante ist. In den meisten Fällen ist der Diffusionskoeffizient variiert nur wenig für die Live-Proben (obwohl, wenn nötig, es kann im Prinzip direkt ausgewertet auch durch ESR ^{6, 10),} und die Spin-Konzentration während der bildgebenden Verfahren erhalten. Daher kann diese Beziehung zur direkten Messung der Sauerstoffkonzentration werden.

Gehen wir zurück zu Abbildung 6 geht hervor, aus der Amplitude Bild, dass die Cyanobakterien-Zellen hauptsächlich auf der rechten Seite des Probenhalters befanden. Darüber hinaus, basierend auf Abbildung 7, ist es klar, dass das Licht die Produktion von O ₂ initiiert und führt zu einem signifikanten Anstieg in der Lösung O _{2-Konzentration,} vor allem in der Voxel in der Nähe der Cyanobakterien.

Abbildung 1: Energie-Ebenen in Elektronen-Spin-Resonanz.

Abbildung 2: Typische Sauerstoffkonzentration Bild einer tumortragenden Maus. Das Bild links zeigt die anatomischen Informationen, auf einem MRT-Bild basiert. Ein stabiles freies organisches Radikal war es, die Maus injiziert und dessen ESR Eigenschaften bieten die Sauerstoffkonzentration an seine Umwelt (rechts). ESR-basierte Ergebnisse sind in der MRT anatomischen Bild überlagert. Sehfeld von 32 mm.

Abbildung 3: Zwei Beispiele für hochauflösende Mikro-Maßstab ESR Bilder von photolithographisch erzeugte Probe mit N @ C ₆₀ Pulver (links) und LiPc paramagnetischen Kristallen (rechts)

Abbildung 4: Typische Hahn bildgebenden Pulssequenz zeigt der Mikrowelle (MW) und Steigung, G _x, G _y und G _z Impulse.

Abbildung 5: Typische Rohdaten ESR Mikro-Bilder: a, b und c sind Rohdaten der Cyanobakterium Probe ohne Beleuchtung für τ gemessen = 500600700 ns bzw.. Items d, e, und sind die gleichen wie a, b und c, aber mit Beleuchtung. Die Intensität ist in willkürlichen Maßstab aufgetragen (ist aber in jedem Satz von drei dunkle oder helle Rohdaten Bilder konsistent)

Abbildung 6: Amplitude entsprechendes Bild der radikalen Konzentration in der Lösung (willkürliche Skala).

Abbildung 7: T ₂ Bilder und die entsprechenden [O _2] Werte unter dunkel (links) und Licht (rechts) Bedingungen.

Diskussion

Dieses Protokoll zeigt, wie ESR Mikro-Imaging eingesetzt werden, um Sauerstoff-Konzentration in der Nähe leben, kleine Proben abzubilden. Eine räumliche Auflösung von ca. 30 x 30 x 100 pm nachgewiesen wird, mit nahezu mikromolaren Sauerstoffkonzentration Sensitivität und sub-Femtomol absolute Sauerstoffempfindlichkeit pro Voxel. Der Einsatz von ESR Mikro-Imaging für Sauerstoff-Mapping in der Nähe Zellen ergänzt die derzeit verfügbaren Techniken der Mikro-Elektroden oder Fluoreszenz / Phosphoreszenz basiert. Darüber hinaus mit der richtigen paramagnetischen Sonde, wird es leicht anwendbar für die intrazelluläre Sauerstoff-Mikro-Imaging, eine Fähigkeit, die andere Methoden finden, sehr schwer zu erreichen. In naher Zukunft planen wir auf eine weitere Verbesserung dieser Methodik zu leben Probe Bilder mit einer Auflösung von wenigen Mikrometern zu schaffen, bietet dagegen Parameter wie Superoxid-Konzentration, Säuregrad (pH), Sonde Diffusionskoeffizienten und, natürlich, Sauerstoffkonzentration. Diese Fähigkeiten sind komplementär zu den aktuellen optischen-basierten Methoden sowohl in Bezug auf Kontrast-Typ und auch von Proben Merkmale (z. B. nicht-transparenten dicken Proben und in einigen Fällen intrazellulären vs extrazelluläre Messungen).

Materialien

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge		Kendro	Heraus, 75003235
Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical		Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.
BG-11 buffer		For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.
Syringe		Hamilton	Microliter 7000.5
Ultraviolet Curing		Norland Products, Inc.	NOA63, or NOA61.