전자 스핀 공명 산소 매핑에 대한 라이브 종의 마이크로 이미징

요약

이 프로토콜은 전자 스핀 공명 현미경 살아있는 세포의 즉각적인 환경에서 산소 농도의 미크론 스케일 입체 영상을위한 방법을 설명합니다.

초록

이 프로토콜은 마이크론 규모의 해상도를 ¹ 살 세포의 즉각적인 환경에서 산소 수준의 세 차원 매핑에 대한 전자 스핀 공명 (ESR) 마이크로 이미징 방법을 설명합니다. 산소 삶의주기에서 가장 중요한 분자 중 하나입니다. 그것은 mitochondria에서 산화 인산화의 터미널 전자 수용체 역할을하고 반응 산소 종의 생산에 사용됩니다. 산소의 측정은 mitochondrial과 신진 대사 기능, 신호 경로, 다양한 자극, 멤브레인 투자율, 그리고 질병 분화의 효과 연구를 위해 중요합니다. 산소 소비 따라서 전체 생물로 세포 mitochondria에서 다양한 생물 학적 시스템에 광범위하게 적용 세포 대사의 정보를 마커입니다. 그 중요성으로 인해, 많은 방법이 사는 시스템에 산소의 측정에 개발되었습니다. 고해상도 산소 이미징을 제공하기 위해 현재 시도는 주로 광학 형광 그들이 높은 사진 독성과 낮은 산소 감도와 프로브를 채용으로 만족스러운 결과를 제공하지 인광 방법을 기반으로합니다. 예제에서 외인성 상자 성체의 프로브의 신호를 측정 ESR은, 산소 농도는 매우 정확한 측정을 제공하는 것으로 알려져 있습니다. 일반적인 경우, ESR 측정 프로브의 lineshape 확대 및 / 또는 지역 산소 농도에 직접 연결된 휴식 시간 단축을지도. (산소는 상자 성체의이며 따라서 외인성 상자 성체의 프로브와 충돌하면 그 휴식 시간을 곤란.) 전통적으로, 실험 이러한 유형의 낮은 해상도, 작은 동물 이미징을위한 밀리미터 규모의 ESR과 함께 진행하고 있습니다. 여기 ESR 영상도 작은 라이브 샘플 시험 마이크론 규모에서 진행 될 수있는 방법을 보여줍니다. ESR 마이크로 이미징은 ^상온이 1 미크론 접근 해상도 공간 - 해결 ESR 신호의 획득을 가능하게 비교적 새로운 방법이다. 이 프로토콜 종이의 주요 목적은이 새로운 방법은, 새로 개발된 산소에 민감한 프로브와 함께, 작은 라이브 샘플에서 산소 수준의 매핑에 적용할 수있는 방법을 보여줍니다. ~ 30 X 30 공간적 해상도는 X 100 μm의는 거의 micromolar 산소 농도 감도와 voxel 당 하위 femtomole 절대 산소 감성으로 증명됩니다. 세포 근처에 산소 매핑에 대한 ESR 마이크로 이미지의 사용은 마이크로 전극 또는 인광 / 형광에 따라 현재 사용 가능한 기술을 보완합니다. 또한, 적절한 상자 성체의 프로브와 함께, 또한 세포내 산소 마이크로 이미징, 다른 방법은 달성하기 매우 어려운 찾기 기능을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. ESR 마이크로 이미징 개요

첫째, 우리는 ESR의 간단한 설명, ESR 현미경, 그리고 시스템의 다양한 구성 요소를 제공하고, 다음 우리는 실제 영상 실험에 대해 설명합니다.

전자 스핀 공명은 특정 주파수에서 전자기 방사선이 외부 정적 자기장 (그림 1) 아래에 배치, unpaired 전자 스핀과 분자에 의해 흡수되는 spectroscopic 기법입니다. ESR이 자유 래디 칼의 상자 성체의 센터의 탐지 및 식별 등 화학, 생물학, 물리학, 재료 과학 등 광범위한 과학 분야에 고용됩니다. 그것은 살아 종의 상자 성체의 분자의 환경을 연구위한 강력한 방법이며 산도 (PH), 점도, 산소와 반응 산소 종의 농도 ^3에 대한 정보를 제공합니다.

이기종 샘플, ESR 스펙트럼 정보는 자기장의 그라디언트 ^4의 사용을 통해, 공간 해결 방법 (즉, 이미지를 획득하여)에서 얻을 수 있습니다. 이것은 주로 양성자의 스핀을 관찰 자기 공명 이미징의보다 일반적인 방법 (MRI)과 매우 유사합니다. 지금까지 이러한 ESR 이미징 기술은 몇 cm의 비교적 큰 크기와 mm 규모의 해상도에 살고있는 표본에 대해 적용되었습니다. ESR 이미징에서 (예를 들어 기준 5 촬영한 그림 2를 참조하십시오.) 비교적 최근의 개발과 함께 mm 및 하위 mm 크기의 샘플 측정 mm 규모의 해상도 작은 동물을보고로부터 기능의 확장 마이크론 규모의 해상도. 이 필드는 1 미크론 ² (그림 3에 대표적인 예제를 참조) 접근 해상도로 3D ESR 이미지를 제공할 수있는 오늘날 ESR 현미경,로 알려져 있습니다.

ESR 현미경은 종래의 ESR 분석기로 본질적으로 비슷합니다. 이것은 인수 과정 및 데이터 처리를 제어하는​​ 정적 필드, 스핀 여기 및 신호 검출을위한 마이크로 웨이브 시스템, 샘플을 보관을위한 탐사 및 전산 콘솔 창출을위한 자석이 있습니다. 다른 구성 요소 독특한 ESR 일반적으로 영상과 ESR 축소 복사도 기존의 이미징 프로브에있는 것을 자성 전자 시스템의 일부 필드 그라데이션 소스, 그리고 경사 코일입니다. 우리가 특정 시스템에 대한 자세한 내용은 프로토콜 영화에 나타난 및 참조 2 설명되어 있습니다.

2. ESR 마이크로 이미징 샘플 준비

이 단계는 ESR 마이크로 이미징 실험을위한 샘플 준비 방법을 설명합니다. 이 단계의 세포의 끝에 trityl 과격한 ⁶ 버퍼 솔루션과 함께 특수 준비 유리 ESR 현미경 샘플 컨테이너의 하단에 표시됩니다. 이 프로토콜은 시아노 세포의 측정을 설명하고 있으므로, 세포의 다른 유형에 대한 적절한 조정은 샘플 준비 단계에서해야 할 수도 있습니다.

1. 첫째, 400 ~ 400 μm의 크기의 흡수성 종이 몇 가지 광장은 촬영과 이후 시아노 정지 1.2 ML (40 MG / ML의 농도에서)으로 가득합니다 Eppendorf 튜브에 삽입됩니다.
2. 정지 microcentrifuge로 6,000 rpm으로 2 분 centrifuged입니다.
3. 이 다음, 표면에 뜨는 버퍼는 완전히 시아노 탈수를 피하기 위해 남아 있습니다 ~ 50 μL를 제외하고 제거됩니다. 이 과정의 결과로, 흡수 종이 이제 시아노 세포에 의해 포화 수 있습니다.
4. 고급 핀셋을 사용하여, 몇 섬유 신문사에서 추출 한 잔처럼 특별히 준비한 유리 샘플 홀더 ⁷ 바닥에 게재됩니다. BG - 11 솔루션 ^{8, 9} trityl의 3 MM은 (스키마 1 참조) 벌금 주사기의 도움으로 샘플 홀더에 추가되어 다음. 홀더 그런 다음 작은 공기 배출구를 열어두고, UV 치료할 수있는 접착제를 사용하여 밀폐 있습니다.
   

   증권 4	증권 3	증권 2	증권 1
   H 3 BO 3 2.86g/liter	K 2 HPO 4 : 3H 2 O 4.0g/liter	MgSO 4 : 7H 2 O 7.5g/liter	나이 MG EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.1g/liter
   MnCl 2 : 4H 2 O 1.81g/liter			산화철 암모늄 구연 산염의 0.6g/liter
   ZnSO 4 : 7H 2 O 0.222g/liter			구연산 : 1H2O 0.6g/liter
   CuSO 4 : 5H 2 O 0.079g/liter			CaCl 2 : 2 시간 2 O 3.6g/liter
   COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter
   NaMoO 4 : 2 시간 2 O 0.391g/liter

   
   제도 1. BG - 11 중간의 작성.

3. ESR 마이크로 이미징 실험

1. 이미징 실험을 시작하려면, ESR 마이크로 이미징 시스템 설정 및 이미징 프로브 내부갑니다되는 공진기에 샘플을 삽입합니다.
2. 이제 컴퓨터 제어 소프트웨어를 사용하여, "조정"모드에서 시스템을 설정하고 ESR 측정에 사용됩니다 프로브의 공진 마이크로 웨이브 주파수를 찾으십시오.
3. 즉, 펄스 시퀀스에 대한 타이밍 파라미터를 설정, 적용 마이크 로파 주파수를 일치하는 값을 정적 자기장을 설정하고 확인 ESR 신호를 관찰할 다음과 같은 것이 아니라 시스템은 기능과 예제는 잘 준비가되어 있습니다.
4. 그런 다음, 이러한 픽셀의 숫자로 이미지 매개 변수, 그라디언트의 강도, 그리고 자신의 필요한 값으로 그라데이션 펄스의 길이를 설정합니다.
5. 설정에 따라 interpulse 분리,  500, 600의 가치, 그리고 700 NS와 안 에코 영상 펄스 시퀀스 (그림 4)에서 세 3D ESR 이미지를 수집합니다.
6. 샘플에 투사된 빛이 필요한 실험 조건에 따라 또는 해제되어 있습니다.
7. 수집하는 동안, 데이터는 자동으로 저장됩니다. 논문 원시 데이터 파일은 다음 trityl 급진적인 집중과 휴식 시간을 기존의 교정을 통해 산소 농도 이미지로 번역된 _{T이지도의} 이미지를 제공하기 위해 Matlab 소프트웨어 스크립트를 통해 처리됩니다.

4. 대표 결과

실험의 결과는 다른 τ 값에 기록된 여러 가지 입체적인 ESR 마이크로 - 이미지입니다. 일반적인 원시 데이터 이미지는 그림 5에서 제공됩니다. 어두운 조건 하에서 측정된 세 가지 이미지, 신호 강도의 감소를 제외하고 매우 비슷합니다. 반면에, 표본의 다른 부분에서 다른 휴식 시간에 따라 빛의 조사에서 이미지 패턴 변경됩니다. 이 데이터는 그림 6에 표시되며 또한 휴식 시간, T ₂ (그림 7)의 이미지, 진폭 이미지를 얻기 위해 ^1을 처리할 수 있습니다. _T이 이미지는 방정식을 통해 휴식 시간에 산소 농도를 연결하는 기존의 교정 곡선을 통해 산소 농도 값으로 변환됩니다

여기, T ₂ ^0은 프로브의 스핀 - 스핀 완화 시간은 anoxic 조건 (프로브의 농도, C, 및 확산 계수, D에 따라 다름) 이하이며, K는 비례 상수이다. 대부분의 경우, 확산 계수는 (필요한 경우, 그것이 원칙적으로 직접 ESR ^{6, 10도} 평가할 수 있지만) 라이브 샘플 많이 다릅니다하지 않으며, 스핀 농도는 이미징 과정에서 얻을 수 있습니다. 따라서이 관계를 직접 산소 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 6로 돌아가고, 그것은 시아노 세포가 주로 시료 홀더의 오른쪽에있는 것을 진폭 이미지에서 분명하다. 또한, 그림 7에 따라, 그것은 빛이 O _2의 생산을 시작하고 주로 시아노 근처 voxels에 솔루션의 O ₂ 농도의 상당한 증가를 일으키는 분명하다.

그림 1 : 전자 스핀 공명의 에너지 수준.

그림 2 : 종양 베어링 마우스의 일반적인 산소 농도 이미지. 왼쪽의 이미지는 MRI 이미지에 따라 해부 학적 정보를 보여줍니다. 안정적인 무료 유기 라디칼은 마우스를 주입하고 ESR 특성은 환경에서 산소 농도 (오른쪽)를 제공했습니다. ESR 기반 결과는 MRI 해부 이미지를 겹쳐 있습니다. 볼 분야는 32mm입니다.

그림 3 : 고해상도 마이크로 스케일 ES의 두 가지 예로N @ C ₆₀ 분말 (왼쪽)와 LiPc 상자 성체의 크리스털로 photolithographically 생성된 샘플의 R 이미지 (오른쪽)

그림 4 :. 전자렌지 (MW)를 표시하고 그라데이션, G _X, G _Y와 G _Z 펄스 전형 안 이미징 펄스 시퀀스

그림 5 : 전형적인 원시 - 데이터 ESR 마이크로 이미지 : A, B 및 C는 = 500600700 NS 각각 τ에 대한 측정없이 밝은 조명과 함께 Cyanobacterium 샘플의 원시 데이터입니다. 항목 D, E와 A, B 및 C로하지만 빛의 조명과 동일합니다. 강도는 임의의 규모 꾸몄다 (그런데 세 어둡거나 밝은 원시 데이터 이미지의 각 집합 내에서 일치)입니다

그림 6 : 솔루션에서 급진적인 농도 (임의의 크기)에 해당하는 진폭 이미지.

그림 7 : _T이 이미지와 해당 [O _2] 어두운 (왼쪽)와 빛 (오른쪽) 조건 값.

토론

이 프로토콜은 ESR 마이크로 이미징 사는 작은 샘플 근처의 산소 농도를지도에 적용할 수있는 방법을 보여줍니다. ~ 30 X 30 공간적 해상도는 X 100 μm의는 거의 micromolar 산소 농도 감도와 voxel 당 하위 femtomole 절대 산소 감성으로 증명됩니다. 세포 근처에 산소 매핑에 대한 ESR 마이크로 이미지의 사용은 마이크로 전극 또는 인광 / 형광에 따라 현재 사용 가능한 기술을 보완합니다. 또한, 적절한 상자 성체의 프로브와 함께, 그것은 세포내 산소 마이크로 이미징, 다른 방법은 달성하기 매우 어려운 찾기 기능을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다. 가까운 미래에 우리는 슈퍼 산화물 농도, 산도 (PH), 프로브 확산 계수, 그리고 물론, 산소 농도 등 대비 매개 변수를 제공, 더욱 몇 미크론의 해상도와 함께 살고 샘플 이미지를 제공하기 위해이 방법을 개선하는 계획이다. 이러한 기능은 대비 유형의 측면에서 또한 샘플 특성 (어떤 경우에는 예를 들어이 아닌 투명 두께 샘플, 세포 대 세포 측정)의 모두 현재의 광학 기반의 방법론을 보완하고 있습니다.

자료

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge		Kendro	Heraus, 75003235
Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical		Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.
BG-11 buffer		For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.
Syringe		Hamilton	Microliter 7000.5
Ultraviolet Curing		Norland Products, Inc.	NOA63, or NOA61.