Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

Resumo

Este protocolo descreve um método para escala mícron imagem tridimensional da concentração de oxigênio no ambiente imediato de células vivas por microscopia eletrônica de spin ressonância.

Resumo

Este protocolo descreve uma ressonância paramagnética eletrônica (ESR) método de micro-imagem para mapeamento tridimensional de níveis de oxigênio no ambiente imediato de células vivas com escala mícron resolução ^1. O oxigênio é uma das moléculas mais importantes no ciclo de vida. Ele serve como receptor de elétrons terminal da fosforilação oxidativa na mitocôndria e é usado na produção de espécies reativas de oxigênio. Medições de oxigênio são importantes para o estudo das funções mitocondrial e metabólicas, vias de sinalização, os efeitos de vários estímulos, permeabilidade da membrana e diferenciação doença. Consumo de oxigênio é, portanto, um marcador informativo do metabolismo celular, que é amplamente aplicável a vários sistemas biológicos a partir de mitocôndrias de células de organismos inteiros. Devido à sua importância, muitos métodos foram desenvolvidos para as medições de oxigênio em sistemas vivos. Tentativas atuais para fornecer imagens de alta resolução de oxigênio são baseados principalmente em fluorescência óptica e os métodos de fosforescência que não fornecem resultados satisfatórios como eles empregam sensores com alta foto-toxicidade e sensibilidade baixa de oxigênio. ESR, que mede o sinal das sondas paramagnéticas exógena na amostra, é conhecido para fornecer medições muito precisas da concentração de oxigênio. Em um caso típico, as medições ESR mapa LineShape ampliação da sonda e / ou tempo de relaxamento-encurtamento que estão ligados diretamente à concentração de oxigênio local. (O oxigênio é paramagnético, portanto, quando colidiu com a sonda paramagnética exógenos, que falta vezes o seu relaxamento.) Tradicionalmente, esses tipos de experimentos são realizados com baixa resolução, milímetro escala ESR para geração de imagens de pequenos animais. Aqui nós mostramos como ESR imagem também pode ser realizado na escala mícron para o exame de pequenas amostras de viver. ESR micro-imagem é uma metodologia relativamente nova que permite a aquisição de sinais espacialmente resolvido com uma resolução ESR se aproximando de 1 mícron em temperatura ambiente ^2. O principal objectivo deste protocolo papel é mostrar como este novo método, juntamente com o recém-desenvolvidos de oxigênio-sensível sondas, pode ser aplicado para o mapeamento dos níveis de oxigênio em pequenas amostras de viver. A resolução espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 M é demonstrado, com quase micromolar sensibilidade concentração de oxigênio e sub-femtomole sensibilidade de oxigênio absoluto por voxel. O uso de ESR micro-imagem para o mapeamento de oxigênio perto células complementa as técnicas atualmente disponíveis com base em micro-eletrodos ou de fluorescência / fosforescência. Além disso, com a sonda paramagnética adequada, mas também irá ser facilmente aplicável para oxigênio intracelular micro-imagens, uma capacidade que outros métodos achar muito difícil de alcançar.

Protocolo

1. Visão geral do ESR Micro-imagem

Primeiro, nós fornecemos uma breve explicação do ESR, microscopia ESR, e os vários componentes do nosso sistema, e em seguida iremos descrever as experiências de imagem real.

Ressonância paramagnética eletrônica é uma técnica espectroscópica em que a radiação eletromagnética em uma freqüência específica é absorvida pelas moléculas com spins elétron desemparelhado, colocada sob um campo magnético externo estático (Figura 1). ESR é empregada em grandes áreas da ciência, como química, biologia, física e ciência dos materiais, para a detecção e identificação de radicais livres e centros paramagnéticos. É um poderoso método para estudar o ambiente de moléculas paramagnéticas em espécies vivas e fornece informações sobre a acidez (pH), viscosidade, oxigênio e espécies reativas de oxigênio concentrações ^3.

Para amostras heterogêneas, ESR informação espectral pode ser obtido de uma forma espacialmente resolvidos (ie, através da obtenção de uma imagem), através do uso de gradientes de campo magnético ^4. Isto é muito semelhante ao método mais comum de ressonância magnética (MRI), que gira principalmente observa próton. Até agora, as técnicas de imagem, ESR foram aplicados para espécimes vivos com tamanho relativamente grande de alguns centímetros e milímetros escala resolução. (Por exemplo, veja a Figura 2, retirados de referência 5.) Desenvolvimento relativamente recente no ESR imagem é a extensão de sua capacidade de olhar para pequenos animais em milímetros escala resolução para as medições de amostras milímetros e sub-milímetro de tamanho com escala mícron resolução. Este campo é conhecida como microscopia de ESR, que hoje pode fornecer imagens 3D ESR com uma resolução de 1 mícron aproximando ² (ver exemplos representativos na Figura 3).

ESR de um microscópio é essencialmente similar a um espectrômetro de ESR convencionais. Ele tem um ímã para a geração do campo estático, um sistema de microondas para a excitação de spin e detecção do sinal, uma sonda para a realização da amostra, e um console informatizado para controlar o processo de aquisição e manipulação de dados. Outros componentes de imagem a única ESR em geral e existentes também em microscopia ESR são fontes de campo magnético de gradiente, que são parte do sistema eletrônico, e bobinas de gradiente que estão localizados na sonda de imagem. Mais detalhes sobre o nosso sistema específico são mostrados no filme de protocolo e descrito na referência 2.

2. ESR Preparação da Amostra Micro-imagem

Esta etapa descreve o método para preparação de amostras para o experimento ESR micro-imagem. No final desta fase as células são colocadas no fundo de um recipiente de vidro ESR especialmente preparado amostra microscopia juntamente com uma solução tampão por tritila radical ^6. Este protocolo descreve a medição de células de cianobactérias e, portanto, para outros tipos de células, ajustes adequados podem ser necessários na fase de preparação da amostra.

1. Primeiro, alguns quadrados de papel absorvente com um tamanho de 400 ~ 400 m são tomadas e inserido em um tubo Eppendorf, que é posteriormente preenchida com 1,2 mL da suspensão cianobactérias (a uma concentração de 40 mg / mL).
2. A suspensão é centrifugada por 2 minutos a 6000 RPM em microcentrífuga.
3. Depois disso, o buffer sobrenadante é completamente removido, exceto para ~ 50 mL que são deixados para evitar a desidratação cianobactérias. Como resultado deste processo, o papel absorvente agora saturados pelas células de cianobactérias.
4. Usando uma pinça fina, algumas fibras são extraídas do papel e colocados no fundo de um suporte de copo-como amostra preparada especialmente de vidro ^7. Seguinte ao de 3 mm de tritila em BG-11 solução de ^{8, 9} (ver Esquema 1) é adicionado ao porta-amostras com a ajuda de uma seringa bem. O titular é então selada com cola curável UV, deixando uma pequena saída de ar aberto.
   

   Stock 4	Stock 3	Stock 2	Stock 1
   H 3 BO 3 2.86g/liter	K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter	MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter	Na 2 EDTA Mg 0.1g/liter
   MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter			0.6g/liter citrato férrico de amônio
   ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter			Ácido cítrico: 1H2O 0.6g/liter
   CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter			CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter
   COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter
   NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter

   
   Esquema 1. Preparação de BG-11 médio.

3. ESR Micro-imagem Experimentos

1. Para começar o experimento de imagem, ligar o sistema ESR micro-imagem e inserir a amostra no ressonador que vai dentro da sonda de imagem.
2. Agora, usando o software de controle de computador, defina o sistema em "Tune" e encontrar o modo de freqüência de microondas de ressonância da sonda, que será usado para as medições ESR.
3. Em seguida, defina o campo magnético estático sobre o valor que corresponda à freqüência de microondas aplicada, definir os parâmetros de tempo para a seqüência de pulso e observar o sinal de ESR para se certificar de que o sistema funcione bem e que a amostra é bem preparado.
4. Em seguida, defina os parâmetros de imagem, tais como o número de pixels, a força do gradiente, bem como a duração dos pulsos de gradiente para seus valores necessários.
5. Após a instalação, coletar três imagens 3D ESR por uma imagem echo Hahn seqüência de pulsos (Figura 4) com interpulso separação, valores de  500, 600 e 700 ns.
6. Luz projetada na amostra é ligado ou desligado, dependendo das condições necessárias experimental.
7. Durante a aquisição, os dados são salvos automaticamente. Teses arquivos de dados brutos são então processadas via Matlab script de software para fornecer imagens da concentração por tritila radical eo tempo de relaxamento T mapa _2, que é traduzido em uma imagem concentração de oxigênio através de pré-existentes de calibração.

4. Resultados representante

Os resultados do experimento são várias tridimensional ESR micro-imagens gravadas em diferentes valores de τ. Típico imagens brutas dados são fornecidos na Figura 5. As três principais imagens, medido em condições escuro, são muito semelhantes, exceto para a redução da intensidade do sinal. Por outro lado, a imagem muda padrão sob irradiação de luz devido aos tempos de relaxação diferentes em diferentes partes da amostra. Estes dados podem ser processados ^​​1 para obter uma imagem amplitude, como mostrado na Figura 6 e também imagens do tempo de relaxação, T ₂ (Figura 7). A T ₂ imagens são traduzidas em valores de concentração de oxigênio através de uma curva de calibração pré-existente que liga a concentração de oxigênio para o tempo de relaxamento através da equação:

Aqui, T ₂ ⁰ é o tempo de relaxação spin-spin da sonda sob condições anóxicas (dependendo da concentração da sonda, C, e seu coeficiente de difusão, D), e k é uma constante de proporcionalidade. Na maioria dos casos, o coeficiente de difusão não varia muito para amostras ao vivo (embora, se necessário, ele pode, em princípio, ser diretamente avaliada também por ESR ^{6, 10),} ea concentração de spin é obtida durante o processo de imagem. Portanto, essa relação pode ser utilizada para medir diretamente a concentração de oxigênio.

Voltando à Figura 6, é evidente a partir da imagem amplitude que as células de cianobactérias foram localizados principalmente no lado direito do titular da amostra. Além disso, com base na Figura 7, é claro que a luz inicia a produção de O ₂ e provoca um aumento significativo da concentração da solução ₂ O, principalmente nos voxels perto do cianobactérias.

Figura 1: Níveis de energia em elétrons de ressonância spin.

Figura 2: imagem de concentração típica de oxigênio de um rato do rolamento do tumor. A imagem da esquerda mostra as informações anatômicas, com base em uma imagem de ressonância magnética. Um estável livre radical orgânico foi injetado para o mouse e as suas características ESR fornecer a concentração de oxigênio em seu ambiente (direita). ESR baseado em resultados são sobrepostos a imagens anatômicas de ressonância magnética. Campo de visão é de 32 mm.

Figura 3: Dois exemplos de alta resolução ES micro-escalaR imagens de amostra photolithographically gerados com N @ C ₆₀ em pó (à esquerda) e cristais paramagnéticos LiPc (à direita)

Figura 4: Típica Hahn imagem seqüência de pulsos mostrando o microondas (MW) e gradiente, G _{x, y} G e G _z pulsos.

Figura 5: Típica-prima de dados ESR micro-imagens: a, b e c são dados brutos da amostra cianobactéria sem iluminação de luz medido para τ = 500600700 ns, respectivamente. Itens d, e, e são os mesmos que a, b e c, mas com iluminação de luz. Intensidade é plotado em escala arbitrária (mas é consistente dentro de cada conjunto de três imagens escuras ou claras de dados brutos)

Figura 6: imagem de amplitude correspondente à concentração de radicais na solução (escala arbitrária).

Figura 7: T ₂ imagens e os correspondentes [O _2] valores no escuro (à esquerda) e leve (à direita) condições.

Discussão

Este protocolo mostra como ESR micro-imagem pode ser aplicada para mapear a concentração de oxigênio próximo ao vivo pequenas amostras. A resolução espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 M é demonstrado, com quase micromolar sensibilidade concentração de oxigênio e sub-femtomole sensibilidade de oxigênio absoluto por voxel. O uso de ESR micro-imagem para o mapeamento de oxigênio perto células complementa as técnicas atualmente disponíveis com base em micro-eletrodos ou de fluorescência / fosforescência. Além disso, com a sonda paramagnética adequada, ela será prontamente aplicável para oxigênio intracelular micro-imagens, uma capacidade que outros métodos achar muito difícil de alcançar. Num futuro próximo pretendemos melhorar ainda mais esta metodologia para fornecer imagens de amostra ao vivo com uma resolução de alguns mícrons, fornecendo parâmetros de contraste, como a concentração de óxido de super, acidez (pH), coeficiente de difusão da sonda e, claro, a concentração de oxigênio. Estas capacidades são complementares à atual ótica metodologias baseadas tanto em termos de tipo de contraste e de amostras de características (por exemplo, não transparente amostras de espessura e, em alguns casos, as medidas contra intracelular extracelular).

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge		Kendro	Heraus, 75003235
Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical		Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.
BG-11 buffer		For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.
Syringe		Hamilton	Microliter 7000.5
Ultraviolet Curing		Norland Products, Inc.	NOA63, or NOA61.