Электронного парамагнитного резонанса Микро-изображения живых видов карт для использования с кислородом

Резюме

Этот протокол описывает метод для микронных трехмерных изображений концентрации кислорода в ближайшем окружении живых клеток с помощью электронного микроскопа спинового резонанса.

Аннотация

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution¹. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature². The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 μm is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

протокол

1. Обзор СОЭ Micro-изображений

Во-первых, мы предлагаем краткое объяснение СОЭ, СОЭ микроскопии и различных компонентов нашей системы, и тогда мы будем описывать реальных экспериментах изображений.

Электронного парамагнитного резонанса является спектроскопический метод, в котором электромагнитное излучение на определенной частоте, поглощается молекулами с неспаренных электронных спинов, помещенных под внешнего статического магнитного поля (рис. 1). СОЭ, занятых в широких областях науки, таких как химия, биология, физика и материаловедение, для обнаружения и идентификации свободных радикалов и парамагнитных центров. Это мощный метод изучения окружающей среды парамагнитных молекул в живых видов и дает информацию о кислотности (рН), вязкость, кислорода и активных форм кислорода концентрации ^3.

Для гетерогенных образцов, СОЭ спектральной информации можно получить с пространственным разрешением образом (например, путем получения изображения), с помощью градиентов магнитного поля ^4. Это очень похоже на более распространенный метод магнитно-резонансной томографии (МРТ), которые в основном наблюдает спины протонов. До сих пор таких изображений СОЭ методы были применены для живых образцов с относительно большим размером несколько сантиметров и в мм масштаба разрешения. (Например, см. рисунок 2, взятый из работы 5.) Сравнительно недавно в ЭПР изображений является расширение ее возможностей, глядя на мелких животных в миллиметровом масштабе резолюции измерения миллиметровом и субмиллиметровом размеров образцов с микронных разрешения. Это поле известно как СОЭ микроскопии, которая сегодня может обеспечить 3D СОЭ изображения с разрешением 1 мкм приближаются ² (см. представитель примеры в рис. 3).

СОЭ микроскопом по существу аналогична обычной спектрометра ЭПР. Это магнит для генерации статического поля, микроволновые системы для возбуждения спиновых и обнаружения сигнала, зонд для проведения выборки и компьютеризированной консоли для управления процессом сбора и обработки данных. Другие компоненты уникальной СОЭ изображения в целом, а также существующие в ЭПР микроскопии обладают магнитными свойствами градиента поля источников, которые являются частью электронной системы, а также градиентных катушек, которые расположены в визуализации зонда. Более подробную информацию о нашей специфической системе показаны в протоколе кино и описан в ссылке 2.

2. СОЭ Micro-изображений пробоподготовки

Эта стадия описывается метод пробоподготовки для ESR микро-изображений эксперимента. В конце этого этапа клетки располагаются в нижней части, специально подготовленные стекла СОЭ контейнере образцы микроскопии совместно с тритил радикальных ⁶ буферного раствора. Этот протокол описывает измерение цианобактерий клетки и, следовательно, и для других типов клеток, надлежащее корректировки могут быть необходимы на стадии подготовки образца.

1. Во-первых, несколько квадратов впитывающей бумагой с размером ~ 400 400 мкм, принимаются и вставляются в трубку Eppendorf который впоследствии заполнены 1,2 мл цианобактерий подвеска (в концентрации 40 мг / мл).
2. Суспензию центрифугируют в течение 2 минут при 6000 оборотов в микроцентрифужных.
3. После этого супернатант буфер полностью удалена, за исключением ~ 50 мкл, которые остаются, чтобы избежать обезвоживания цианобактерий. В результате этого процесса, впитывающей бумагой сейчас насыщенный сине-зеленых водорослей клетки.
4. Использование тонких пинцеты, несколько волокон выделяются из бумаги и помещают на дно чашки, как специально подготовленные держатель образца стекла ^7. После этого 3 мм тритил в BG-11 решение ^{8, 9} (см. схему 1) добавляется к держателю образца при помощи тонкого шприца. Затем патрон запечатаны использованием УФ-клей, оставляя небольшой выход воздуха открытым.
   

   Сток 4	Складе 3	Складе 2	Месте 1
   H 3 BO 3 2.86g/liter	K 2 HPO 4: 3 H 2 O 4.0g/liter	MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter	Na 2 Mg ЭДТА 0.1g/liter
   MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter			Железа 0.6g/liter цитрата аммония
   ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter			Лимонная кислота: 1H2O 0.6g/liter
   CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter			CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter
   CoCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter
   NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter

   
   Схема 1. Подготовка BG-11 среды.

3. СОЭ Микро-изображения Эксперименты

1. Во-первых изображений эксперимент, включите СОЭ микро-система формирования изображений и вставьте образца в резонаторе, которая идет внутри изображений зонда.
2. Теперь, используя программное обеспечение компьютерного управления, установить систему на фирме "Мелодия" режиме и найти резонансную частоту микроволнового зонда, который будет использоваться для измерения ESR.
3. После этого, установите статического магнитного поля на значение, которое соответствует применяются СВЧ, установить временные параметры для импульсной последовательности и наблюдать сигнал ЭПР, чтобы убедиться, что система работает хорошо, и образец хорошо подготовлены.
4. Затем установите визуализации параметров, таких как количество пикселей, сила градиентов и длину градиента импульсы к их нужные значения.
5. После установки, собрать три 3D-изображений, СОЭ эха Хана визуализации последовательности импульсов (рис. 4) с межимпульсный разделения, значения 500 , 600 и 700 нс.
6. Свет прогнозируется на уровне образец включен или выключен в зависимости от требуемых условий эксперимента.
7. Во время приобретения, данные автоматически сохраняются. Тезисы исходных файлов данные затем обрабатываются с помощью программного обеспечения Matlab сценарий предоставить изображения тритил радикальных концентрации и релаксации T ₂ карты, которая переводится на изображение концентрации кислорода через уже существующие калибровки.

4. Представитель Результаты

Результаты эксперимента несколько трехмерных СОЭ микро-изображения, записанные при различных значениях τ. Типичные необработанных изображений данные приведены на рисунке 5. Тройку изображений, измеренная в темное время суток, очень похожи, за исключением сокращения интенсивности сигнала. С другой стороны, изображение картины изменения под облучении светом из-за различных времен релаксации в различных частях образца. Эти данные могут быть обработаны ^1, получим амплитуду изображения, как показано на Рисунке 6, а также образы время релаксации, T ₂ (рис. 7). Т ₂ изображения переводятся в значения концентрации кислорода через уже существующие калибровочной кривой, которая связывает концентрацию кислорода к времени релаксации с помощью уравнения:

Здесь T ₂ ⁰ является спин-спиновой релаксации зонда в бескислородных условиях (в зависимости от концентрации зонда, C, и ее коэффициент диффузии, D), и к-коэффициент пропорциональности. В большинстве случаев, коэффициент диффузии не сильно отличается для живых образцов (хотя, при необходимости, она может быть в принципе непосредственно оценить также на ^{6 СОЭ, 10),} и спина концентрации, полученные в ходе визуализации процесса. Таким образом, это отношение может быть использован для прямого измерения концентрации кислорода.

Возвращаясь к рис 6, как видно из изображения, которое амплитуда цианобактерий клетки расположены в основном на правой стороне держателя образца. Кроме того, исходя рисунке 7, ясно, что свет начинает производство O ₂ и приводит к значительному увеличению концентрации O ₂ решения, в основном в вокселей возле цианобактерий.

Рисунок 1: Энергетические уровни электронного парамагнитного резонанса.

Рисунок 2: Типичный образ концентрации кислорода в опухоли мышей подшипника. Изображение слева показывает анатомические сведения, основанные на МРТ изображение. Устойчивые свободные органический радикал вводили мыши и ее СОЭ характеристики обеспечивают концентрацию кислорода в окружающей среде (справа). СОЭ основе результатов накладываются на МРТ анатомические изображения. Поле зрения составляет 32 мм.

Рисунок 3: Два примера высокого разрешения микро-масштабе ESR образы photolithographically генерируемых образца с N @ C ₆₀ порошок (слева) и LiPc парамагнитных кристаллах (справа)

Рисунок 4: Типичные Хан визуализации последовательности импульсов показывает микроволновые (СВЧ) и градиент, G _{х, у} G и G _Z импульсов.

Рисунок 5: Типичные необработанных данных СОЭ микро-изображений: а, б, в сырые данные цианобактерии образца без света, освещенность, измеренную при τ = 500 600 700 нс, соответственно. Элементы г, д, и такие же, как, б, в, но светом освещения. Интенсивность строится в произвольном масштабе (но последовательно в пределах каждого набора из трех темных или светлых необработанных изображений данных)

Рисунок 6: Амплитуда изображение, соответствующее концентрации радикалов в растворе (произвольном масштабе).

Рисунок 7: T ₂ изображений и соответствующих [O _2] значения при темных (слева) и легкой (справа) условиях.

Обсуждение

Этот протокол показывает, как СОЭ микро-изображения могут быть применены к карте концентрации кислорода около жить малых выборок. Пространственным разрешением ~ 30 х 30 х 100 мкм свидетельствует, с почти микромолярных кислорода чувствительности концентрации и суб-femtomole абсолютная чувствительность кислорода в воксела. Использование ESR микро-изображений для отображения вблизи кислорода клетками дополняет имеющиеся в настоящее время методы, основанные на микро-электродов или флуоресценции / фосфоресценции. Кроме того, с надлежащим парамагнитного зонда, то она будет легко применимы для внутриклеточного кислорода микро-изображения, возможности которых другие методы найти очень трудно достичь. В ближайшем будущем мы планируем дальнейшее совершенствование этой методологии предоставить образец изображения в реальном времени с разрешением в несколько микрон, что обеспечивает контрастность параметры, такие как супер концентрации оксида, кислотность (рН), датчиком коэффициента диффузии и, конечно, концентрации кислорода. Эти возможности дополняют текущий оптико-обоснованных методик как с точки зрения контраста типа, а также образцов характеристик (например, непрозрачная толстых образцов, а в некоторых случаях, внутриклеточные против внеклеточного измерений).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Kendro	Heraus, 75003235
Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical	Novosibirsk		Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.
BG-11 buffer			For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.
Syringe	Hamilton Co	Microliter 7000.5
Ultraviolet Curing	Norland Products, Inc.	NOA63, or NOA61.