組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

要約

エレクトロ足場は、組織工学アプリケーションのためのポストプロダクションを処理することができます。ここでは、複雑な足場を回転するためのメソッドを（連続した回転で）記述し、厚い足場（マルチレイヤーによる熱を使用するか、水蒸気アニール）を行うために、無菌性（無菌製造又は殺菌のポストプロダクション）を達成するために、適切な生体力学的特性を達成するために。

要約

エレクトロスピニングは、3次元組織工学用の足場を（多くの場合、生分解性）を生成する一般的に使用され、汎用性の高い方法である^1、2、in vivoでの ³の多くの組織は、子どものような皮膚、膀胱、骨盤底、さらに硬口蓋など様々なエクステントに軸膨満を受ける成長します。これらの目的のための足場を製造する際に適切な生体力学的特性の足場（細胞なしかを達成するかどうか）と臨床使用のために無菌であるを開発する必要がある。この論文の焦点は、基本的なエレクトロ·パラメータ（エレクトロスピニングに関する広範な文献があるように）確立する方法はありませんが、彼らは組織工学の目的のために収まるようにスパンの足場のポストプロダクションを変更する方法 - ここでの厚さ、機械的性質と滅菌（ために必要な臨床使用）を考慮し、我々はまた、細胞が足場上で培養し、特定のアプリケーションの条件に軸ひずみにそれらを付すことができる方法について説明しています。

エレクトロスピニングは、薄いシートを生成する傾向がある。エレクトロコレクタは、繊維を絶縁でコーティングになり、そのような貧しい指揮者になると、その上繊維が、もはや預金いる。したがって、私たちは、熱や蒸気が足場の強度が、必ずしも弾力性を増加させるアニールすることによって、より厚い構造を生成するためのアプローチについて説明します。複雑な足場を達成するための様々なポリマーの足場の連続した​​回転にも記載されています。滅菌の方法論に悪影響足場の強度と弾力性に影響を与えることができます。我々は、ポリ乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）のエレクトロ足場上での生体力学的特性に及ぼす影響は、以下の3つの方法を比較します。

足場と足場の上で細胞による細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の産生の評​​価に関する細胞のイメージングは​​、記載されています。 in vitroでの足場上で培養する細胞は足場の強度と弾力性が、組織工学literatuを向上させることができます再細胞は、しばしば静的な条件下で培養するときに、適切なECM​​を生成するために失敗することを示しています。いくつかの商用システムでは、動的な調整体制下の足場で培養細胞に1つ許可されていることをご利用いただけます- 1つの例では、メディア内に充填室をメカニカルグリップを使用して開催された足場の細胞上でコンディショニングプログラムを発揮するために使用することができボースElectroforce 3100である⁴ 2次元で制御された歪みの予算細胞培養バイオリアクターへのアプローチが記載されている。我々は、細胞がこれらの条件の下でエラスチンを生成するために誘導することができることを示している。最後に、細胞の有無にかかわらず培養処理足場の力学的特性の評価が記載されています。

プロトコル

1。ランダムおよび整列繊維のエレクトロスピニング

エレクトロスピニングは、接地コレクタに向かってポリマー溶液を描画する電位を用いて微細な繊維状のネットワークを作成します。コレクターは非常に多くの形状にすることができ、静的または、より一般的に、回転することができます。解決策の前に溶媒が蒸発するには、コレクタに到着し、ジェット機は、繊維に固化する。

各ポリマーは繊維の特定のタイプを生成する条件の独自のセットを必要とします。ポリマーの濃度は、溶媒ポンプソリューションと接地コレクタ、2​​間の電位差の間の距離は、回転コレクタ、流量、温​​度および湿度の速度はすべてのエレクトロに影響します。パラメータとどのように生産の足場（例えば、繊維径、形態、および方向）にこれらの影響をエレクトロスピニングの選択を記述する多くの研究があります^{。5、6、7、8}これらの実験では足場は、私たちの以前の研究で選択した条件に基づいて回転させた^。2、9

次のメソッドは、 図1に示すように回転するコレクタを使用してPLGA、ポリ乳酸（PLA）、ポリε-カプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシブチレート-コ- hydroxyvalerate（PHBV）からエレクトロ足場の製造に適しています。ジクロロメタン溶媒を通して（DCM）が使用されます。ここでの方法は、マイクロサイズのビーズ（ "真珠のネックレス"の形態）でmicrofibrous PLGA、PLAとPCLとナノ繊維PHBV足場を生成します。

1. コー​​ト外側を向く光沢/洗練された側に、アルミホイルでマンドレルコレクタを回転させる。私たちのマンドレルは、幅20センチ、直径10 cmであった。
2. ポリマー溶液を調製し、PLA、PCLとPHBVは、DCM中の10重量％溶液として構成されています。 PLGAは、DCMの20重量％溶液として構成されています。
3. シリンジポンプに5 mlの容積の4つの注射器を配置します。注射器は、Cにロードされます合計で20ミリリットルを与えて、ポリマーの各5 mlをontain。
4. PLAには、PCLとPHBVは、シリンジ^40μLmin-1の流量を使用しています。
5. PLGAのシリンジあたり^30μLmin-1の流量を使用しています。
6. PLAには、PCLおよびPLGAは、針先端からマンドレルに17cmのワーキングディスタンスを使用しています。
7. PHBV用マンドレルへの針先端から10cmのワーキングディスタンスを使用しています。
8. アルミ箔コーティングされたマンドレルに適切な距離から17000 V（73030 P、Genvolt、シュロップシャー州、イギリス）とelectrospinに注射針を充電してください。
9. ランダム繊維は200 rpmでマンドレルを回転させます。
10. 整列繊維を1000 rpmでマンドレルを回転させます。
11. 足場は、乾燥条件下でアルミニウム箔上に格納することができます。推奨されるストレージは、乾燥剤の存在下で4℃で密閉容器である。我々の経験では足場は、（我々はすべてのPUに気づいていないこれらの条件の下で少なくとも4ヶ月間（おそらくはるかに長い）が安定している足場の長期保存条件でblished研究）。

2。シーケンシャル紡糸により複合足場の製造

シーケンシャル回転は、両方のプロパティの最高を有する材料を作成するために、異なる材料の特性を組み合わせる方法を提供しています。 PLAまたはPCL回転が低密度弾性シートを生成するのに対し、PHBVには、フラット、緻密な、脆いシートを生成します。両方の材料は、細胞接着をサポートしています。連続して弾力のある密度の高い細胞透過性の膜でこれらの材料の結果を紡績。

1. PHBV紡糸条件では、セクション1のように、エレクトロスピニングリグを設定します。
2. 上記のようにElectrospin PHBV。
3. アルミ箔を変更せずに、electrospinそのポリマー（例えば17センチメートル針にドラム、PLAのための17000 V、200 rpm）でのパラメータと、通常の条件を使用して、上に第二のポリマー。この添加剤のプロセスでは、二重層を製造する足場の二重層を構築します。

3。一緒にいくつかの層をアニールすることにより、積層足場の製造

1. 足場は、アニール熱を使用して多層ことができます。 PLGAのこの4枚を互いの上に配置されて行い、その後3時間60°Cでアニール加熱する。
2. 足場は、また蒸気がアニールによってアニールすることができます。 PLGAのここで4枚は、互いの上に置かれ、1時間、DCMのプール上記の2つのCM（10 ml）を懸濁させる。これは、室温で密閉容器で実行されます。

4。エレクトロ足場の無菌生産とポストプロダクション滅菌

1. 無菌足場生産はクリーンルーム環境内の層流フードの無菌環境下でエレクトロスピニングによって達成することができる。行うためにDCMでインキュベートすることにより滅菌医療グレードまたはポリマーのこのどちらかの無菌性ポリマーを使用することができます。一度溶解し、ポリマーは、次のように周りに包まれた無菌の箔上にエレクトロされて​​いるマンドレルをterilised。足場は、その後無菌的に処理されます。不妊は、適切な期間抗生物質を含まない増殖培地で足場のサンプルをインキュベートすることによって検証されます。
2. エタノール消毒のために（これは実験的に使いやすですが、クリニックに取ることができる滅菌の認識論ではありません）足場は、蒸留水、エタノールの70％（v / v）の溶液中で（15分）簡単に配置されています。実用的な実験的な目的のためにこれは通常、彼らはその後、培養細胞で正常に組み合わせることができるように足場を駆除するのに十分である。
3. セリムらで説明したように過酢酸滅菌の足場のために過酢酸に浸漬されている（0.1％v / vのリン酸食塩水（PBS）のバッファ）と室温で3時間インキュベートした^。9
4. ガンマ線滅菌用足場は、セリムらで説明したようにセシウム源を用いた3 kグレイの線量で照射されています^。9

5。足場の生体力学的試験

1. 足場は、長方形の5ミリメートル×20マイクロメーターを用いて厚さを測定ミリメートル、およびボーズElectroforce 3100楽器に配置さにカットされています。このマシンは6mmとプロットの応力/ひずみ曲線と負荷対変位の変位に0から22 Nの力を適用します。これは、ヤング率と弾性を計算することができます。

6。足場上のセルをビジュアル化し、ECMの生産を評価する

細胞は、1彼らは添付のように、足場上のセルを参照して移行し、増殖することが極めて重要な蛍光色素で染色することができます。ポスト文化は足場上での細胞の存在は、4 ',6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）で細胞核を染色により決定することができる。足場上の細胞によるECMの産生は、この例に示すようにエラスチンを含むECMタンパク質の範囲の細胞を染色することにより評価することができる。使用されるすべての足場は、持って測定した。正方形X 1.5センチメートル前の播種〜1.5 CMに少なくとも0.2ミリメートルとカットの厚さ。

これらの研究でヒト皮膚線維芽細胞があるため、彼らが我々の研究室の主な研究対象である軟部組織の再建に果たす役割の中で使用されます。

細胞は、乳房縮小または腹部（同意が研究目的に使用されるそれらの組織のために与えられた）のために待機手術を受ける患者から皮膚サンプルから得られます。組織を採取し、研究組織バンクのライセンス12179の下で匿名で使用されています。組織は、PBSを含むストレプトマイシン（0.1 mg / ml）とペニシリン（100 IU / ml）とアムホテリシンB（0.5μg/ ml）で洗浄する。組織サンプルは、0.1％（w / v）のトリプシン、PBS中0.1％のグルコース（12-18時間、4℃）でインキュベートする。真皮を剥離し、細かくみじん切りとコラゲナーゼの10ミリリットル（DMEM中の0.5％（w / v）の、10％FCS、37℃で18時間C）と共にインキュベートした。得られた細胞suspensの遠心分離イオンは（10分400 g）を、ウシ胎児血清（FCS、10％v / v）を添加したDMEMで培養し、継代培養することが可能で、細胞のペレット、ストレプトマイシン（0.1 mg / ml）を、ペニシリン（100 IU /を生成しますml）とアムホテリシンB（0.5μg/ ml）を。通路4-9の唯一の線維芽細胞を実験に使用されています。

1. T75に一度合流ヒト皮膚線維芽細胞は、（EasyFlask、Nunc社、ニューヨーク、米国）で5分間インキュベートし、トリプシン/ EDTA（5ミリリットル、5 mg / mlのトリプシン、2生理食塩水中のmg / mlのEDTA）を添加することにより播種され37℃懸濁液を10分（150グラム）で遠心分離されています。細胞は、DMEM、5mlの（FCS（10％V / V）、ストレプトマイシン（0.1 mg / ml）を、ペニシリン（100 IU / ml）とアムホテリシンB（0.5μg/ ml）を添加）に再懸濁し、使用してカウントされているhaemocytometerと、濃度は播種用に調整されます。細胞は通常、ウェル当たり50,000細胞で播種されています。
2. 前の足場に細胞を播種し、必要であれば、細胞は、赤または緑CellTrackerを使用して、事前にラベルを付けることができます。セルsは3×5 mlのPBSで洗浄されています。 （10ml）を無血清、細胞を適当な培地中の10mM CellTrackerのソリューションが追加され、細胞を37℃で45分間℃でインキュベートする。インキュベーション後、細胞は、それが足場に播種されている3×5 mlのPBSに次のように洗浄される。 620nmのλem（CellTracker赤）と480nmのλex - - 533 nmのλem（CellTracker緑）この後足場の表面を570 nmλexで軸索ImageExpress顕微鏡（Molecular Devices社、サニーベール、米国）に結像することができます。足場をより深く細胞の侵入を調査するために多光子共焦点顕微鏡を使用することができます。これは、細胞の有無にかかわらず、ほとんどの足場に200ミクロンの浸透の周りに達成することができます。
3. 投稿培養試料を20分間37℃でPBSで1ミリリットル3.7％ホルムアルデヒドで固定し、3×1 mlのPBSで洗浄されています。
4. エラスチン一次抗体200μLを各サンプルに追加されます（PBSで5％（v / v）の、ウサギ抗ヒトアルファELASスズ、AbDserotec、Kidlington、英国）と30分間37℃でインキュベートした。
5. サンプルは3×1 mlのPBSで洗浄し、次いで二次抗体の溶液（0.5％v / vのヤギ抗ウサギIgG（FC）：FITC）でインキュベートされる30分間DAPI（1μg/ mlの）を含むPBSインチ
6. この次のサンプルは、3×1 mlのPBSで洗浄されています。
7. DAPIと480nmのλexは460 nmのλem - - 二次抗体のために533 nmのλemDAPIおよび二次抗体染色サンプルは、その後アクソンImageExpress蛍光顕微鏡、365nmのλex上に結像されています。 DAPIは、汚れの核を、1つは非常に容易に繊維内の細胞の分布を確認することができます。

7。二軸動的なコンディショニングに足場に供する細胞

線維芽細胞のECM産生に対する動的な調整の影響を調べるために、我々はこれを探求するための単純な概念実証バイオリアクターを開発しました。

1. バルーンと流れを組み立てる調節装置およびそれが被覆されたら、それは容易に細胞培養に適した滅菌容器内に配置することができるようにシステムを準備します。
2. バルーン（1時間122°C、220ミリバール）を含む装置をオートクレーブします。私たちは風船に悪影響膨張を繰り返し、それらをしぼませることにより、その機能に影響を与えずにオートクレーブ生き残ることを確認できます。
3. クリーンルーム内で、上にエレクトロになる位置に層流フード内で装置を解凍します。
4. リン酸緩衝生理食塩水で必要な表面積（バルーンはまだ培養容器に収まるように必要が覚えている）にバルーンを膨らませる、無菌である必要はありません。装置の点で電気的に地球にPBSを接続する（分岐パイプを上3-wayハンドタップ）。
5. Electrospin通常の紡糸条件を使用して、バルーンの上に必要なポリマー、10cmのワーキングディスタンスを使用します。足場で1時間乾燥させます。 "ぬれた"繊維は、サーフィンに付着するのに十分な "スティッキー"であるその後デタッチせずバルーンのエース。
6. 滅菌容器内にバルーンを配置し、細胞培養に適した層流フードに移送。
7. ピペットで細胞懸濁液（DMEM 5 mlの1×10 ⁶細胞）を配布しようとする20分間コーティングしたバルーンに滅菌表面に容器と場所（ペトリ皿）からバルーンを削除し、繰り返して（20秒ごとに）表面上に均一に細胞。
8. 培養容器内にバルーンを配置し、予め温めておいたメディアの細胞タイプに適切に追加します。
9. シリンジポンプ（ケント科学、魔神プラス、​​コネチカット州、米国）にインフレ装置を接続し、軸膨満を与えるために、必要に応じてバルーンを膨らませて/空気を抜く。コンピュータ制御のシリンジポンプは、より複雑な膨満体制を達成するために使用することができます。

8。代表的な結果

次の図は、期待できる代表的な結果である上記の方法に従っている場合。

エレクトロスピニングは、ランダムと秩序のアーキテクチャ（ 図1）足場を作成するために利用することができ、これは反復可能であると繊維が均一である。ポリマーの多くの種類がかなりとしてPHBV、PLAまたはPCLのために図2に示すように変えることができる特性を持つエレクトロことができます。エレクトロスピニングは軽いふわふわした足場、または密集し細胞膜を通さない（ 図3を参照）を生成することができます。ここに示されているすべての足場は、細胞接着と増殖を促進した。前の仕事は、細胞は少なくとも500から600μmの深さにこれらの足場を通って移行することが示されているPLA ^9を平均繊維径が3μmである。PHBVのためにそれは5から20ミクロンに至るまで真珠と0.3μmである。のためにPCLそれは3μmであり、PLGAのためにそれは11μmである。他の溶媒系を使用して、他の研究では、PHBVビーズやポリマー真珠なく、繊維のようなエレクトロであることを報告している^。10,11

厚い足場が必要な場合はアニーリング蒸気と熱が一緒に足場の層をアニールするために用いることができる（ 図4を参照）。これらの足場層が剥離せず、それが層の間の接合を見つけるのは非常に困難な場合があります。

我々は、細胞がAおよびBはそれぞれ図5に示すように混ざりせずに独立した膜上で培養することができる二重層膜を作ることができることを示している。ここでは、2つの異なる蛍光細胞トラッカー色素で着色されたヒト皮膚線維芽細胞を使用することによって、これを示しています。培養細胞は、口蓋裂の修復または再建歯のような他の側にソフト（と通常より速く成長している）組織を形成するために設計された細胞から分離片側に、骨や軟骨などの硬組織を形成するとき、そのような二重層膜は有用であろう手術^12、13

私たちが持っているエレクトロ足場上で滅菌の影響に関して以前は足場とその後の細胞培養で滅菌の影響の方法と報告している^。9これは、図6に示されている繊維径と引張強度とPLGA足場のヤング率に過酢酸、ガンマ線照射とエタノールの効果を示している。

過酢酸とエタノールが約50％、繊維径を減少させるのに対し、ガンマ線照射は、繊維径に有意な影響を与えません。引張強さに対する滅菌の各メソッドの、究極の引張強さと足場の弾力性を変えました。これらの足場に細胞の培養は、さらに究極の引張応力を減少させますが、弾力性を増加させた。

最後に、エレクトロ足場上で培養した細胞上での動的軸膨張の効果をテストする方法が示されています。この概念実証のアプローチは、細胞はダイナミックの間に生存し続けることを示しています膨満感だけでなく、これらの条件の下でエラスチンの増加量を生成します。これは、同じ足場上の同じ細胞は（ 図7を参照）静的な条件の下で維持されているエラスチンの不足のために著しく対照的である。

図1。エレクトロスピニングリグの、お互いの上に配置繊維のランダムと平行繊維を紡績し、層の漫画を表示します。垂直繊維は、アルミニウム箔上に整列した繊維の集合をエレクトロ90でホイルを回転させ°とし、すぐにこれらの上に整列し、繊維の2番目のセットをエレクトロスピニング作成することができます。

図2（C）PCL（スケールバーは、（B）PHBV（スケールバーは100μmである）、（A）PLA（スケールバーは100μmである）のランダムなエレクトロマットの形態を表示します。 100μm）と（D）PLGA（スケールバーは200μmである。） PLA、PCLおよびPLGAは、すべてのmicrofibrous均一な足場であることに注意してください。 PHBVは5から20ミクロンサイズのビーズを接続してナノファイバーの"真珠のネックレス"としてスピンオフされています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3多層足場の生産。ここでは足場は、最初にPHBVを使用してスピンされ、その後、PLAまたはPCLで満たされた注射器が使用されています。これらはPHBV足場の上にスピンされています。図は、これらの多層足場の外観を示し、（A）は、単一のPHBV層、PHBV-PLA二重層（B）の断面、高密度ナノ繊維を示す、 "真珠のネックレス" PHBV層（左）と、よりオープンmicrofibrous PLA層（右）と（C）は、単一のPLA層を形成する。nkは">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

図4：厚い足場は、熱アニーリングと水蒸気アニールすることにより製造することができる。 （A）と（B）約150μmの初期繊維状足場が一緒に置かれており、ジクロロメタン蒸気が500μmまでの非常に厚い足場を作るために使用される蒸気アニールPLA足場の断面を示しています。で（C）と（D）は、1つは、足場が一緒に薄いと厚い繊維の層をアニールする熱によって作成された薄い繊維の層が点在はるかに厚い繊維の層から構成されていることがわかります。このアプローチは、複雑な機械的性質の足場を生成するために使用することができます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

Fiのグレ5。二重層足場上のセルの外観。すべてのケースでは、細胞が存在するヒト皮膚線維芽細胞である。 （A）細胞を固定し、DAPIで染色されているエレクトロPLA上で線維芽細胞。 PHBV上に（B）DAPI染色した細胞。で（C）線維芽細胞は生体染色色素、CellTracker緑との事前染色され、あなたは二重層のPLA側にそれらの外観を見ることができます。 （D）上部のPLA表面の下PHBV面と緑のステンド線維芽細胞上に赤いステンド線維芽細胞の脂質二重層を介して参照してください。 （E）線維芽細胞はPHBVの表面上に成長させたCellTracker赤で前染色した。極めて重要な蛍光色素の使用は、細胞が成長を続けている間に足場上の細胞の分布を調べるための便利な方法論を提供します。一つは、定期的に少なくとも7日間これらの染料を使用することができます。しかし、染料の濃度は、細胞が分裂すると希釈になります。スケールバーは0.1mmに等しい。

g6.jpgの "alt ="図6 "/>
図6。エレクトロ足場の力学的特性はボーズElectroforceテンシオメータデバイスを（）を使用して取得されています。 （B）PLGAの応力/ひずみ曲線は、ガンマ線照射、アルコール、過酢酸、または無菌的に生産することによって滅菌足場。それが壊れる前に、繊維が受けることができるための究極の引張応力（UTS）、究極の引張ひずみとヤング率：3つの測定値は、そのようなグラフから取得することができます。後者は、足場の弾力性の指標を与える。 （C）μmでPLGA繊維の直径上の各滅菌法の効果。各滅菌方法は、UTSの減少となりました。過酢酸とガンマ線照射の両方がより弾力的足場を与えてヤング率を低下させ、アルコールは足場が特に脆いことができます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図7は、この図は、足場（スキャフォールドと内に増殖する細胞）が時間の期間にわたって軸膨満に供することができるとなる軸バイオリアクターを提供するためのシンプルなバルーンの使用方法を示します。 （A）エレクトロ繊維、PHBVは、寄託されたその上に収縮バルーンが。この段階では、バルーンの一部が繊維で覆われています。 （B）バルーンが完全にPHBVとPLA繊維で被覆された。 （C）細胞懸濁液を繰り返しバルーンにピペッティングしています。 （D）バルーンがシリンジポンプとPBS（伝導性電解質として使用される）に接続されている無菌のメディアボトル内に配置されたバルーンは静かに膨らませるとプログラムされたスケジュールに対してバルーンのデフレーションを可能にするために使用されています。 （E）に示すように、細胞の生存のために実施実験と解析の終了時にバルーンから削除された足場上のセル（F）は、生細胞は暗い青色を開発する場所代謝INDを使用して、icator 3 - （4,5 - ジメチルチアゾール-2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロミド。 （G）、静的な条件下で培養された同一の足場（H）上の同じ細胞はごくわずかエラスチンの生産を持っているのに対し、細胞（青）は、このバルーンと軸膨満の対象とエラスチン線維（緑、エラスチンに特異的な抗体を用いて染色された）を開発する上で培養することを示します。スケールバーは0.025ミリメートルに等しい。

ディスカッション

それは技術はまた、多くの変数を持つ複雑かつ多面的で実験的な使用のために基本的なエレクトロの足場を生成することは比較的簡単ですが、エレクトロスピニングは^、14組織工学用の足場を製造するための非常に人気のある手法である^{15、16 6。}方法を説明する多くの研究があります。エレクトロスピニングのパラメータは、足場が生産を決定します。本研究で焦点が適切な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリ乳酸 - コ - グリコール酸	シグマアルドリッチ
ポリ乳酸	シグマアルドリッチ	81273	固有粘度2.0dl〜/ gで
ポリε-カプロラクトン	シグマアルドリッチ
ポリヒドロキシブチレート - コ - hydroxyvalerate 12時01	グッドフェロー	578-446-59	PHB88/PHV12
ジクロロメタン	シグマアルドリッチまたはフィッシャー	270997またはD/1850/17	> 99.8％は50-150ppmアミレン安定剤が含まれています
50色とりどりの風船	ウィルキンソンのハードウェア店（株）	0105790
ヤギ抗ウサギIgG（FC）：FITC	AbDserotec	STAR121F
ウサギ抗ヒトαエラスチン	AbDserotec	4060-1060
スクリューキャップGL45 PP 2ポート、PK / 2	SLS	1129750
4 ',6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール二塩酸塩	シグマアルドリッチ	32670
CellTracker緑CMFDA	インビトロジェン	C7025
CellTracker赤CMTX	インビトロジェン	C34552