조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

요약

Electrospun의 공사장 공중 발판은 조직 공학 응용 프로그램을위한 포스트 프로덕션을 처리할 수 있습니다. 여기 불임 (무균 생산 또는 멸균 포스트 생산)을 달성하기 위해하고 적절한 biomechanical 속성을 달성위한 두꺼운 공사장 공중 발판을 (멀티 layering이 열을 사용하거나 증기가 풀림으로) 제작을 위해, 복잡한 공사장 공중 발판을 (연속 회전으로) 회전하는 방법을 설명합니다.

초록

Electrospinning는 3D 조직 공학을위한 공사장 공중 발판을 (종종 생분해성) 생산 일반적으로 사용하고 다양한 방법입니다. ^{1, 2,} 생체내 ³ 대부분의 조직과 같은 피부, 방광, 골반 바닥, 심지어 어린이와 같은 하드 구개 등 extents를 변화에 biaxial 팽만을 받다 성장. 이러한 목적을 위해 공사장 공중 발판을 생산에 적절한 biomechanical 속성의 공사장 공중 발판을 개발 (세포없이 또는 함께 달성 여부) 및 임상 용도 멸균되어있는 할 필요가있다. 여기에 두께, 기계적 성질 및 살균 (필요 -이 논문의 초점은 기본 electrospinning 매개 변수 (electrospinning에 대한 광범위한 문학가로) 설립 있지만 그들이 조직 공학의 목적에 적합하도록 잣고 공사장 공중 발판 포스트 프로덕션을 수정하는 방법에 대한 방법 않습니다 임상 사용)으로 간주하고 우리는 또한 세포 공사장 공중 발판을 배양해 및 특정 애플 리케이션을위한 조건을에 biaxial 변형을 받다 수있는 방법에 대해 설명합니다.

Electrospinning는 얇은 시트를 생산하는 경향이; electrospinning 수집기는 섬유 절연 코팅되어 이건 정말 가난한 지휘자되면서 그 위에 섬유는 더 이상 보증금니다. 따라서 우리는 열 또는 증기가 필요하지 않게 탄력을 공사장 공중 발판의 강도를 증가 소둔 있지만하여 두꺼운 구조를 생성하기 위해 방법을 설명합니다. 복잡한 공사장 공중 발판을 달성하기 위해 다른 폴리머의 공사장 공중 발판의 연속적인 회전도 설명되어 있습니다. Sterilisation 방법론에 부정적인 강도와 공사장 공중 발판의 탄력에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 폴리 락트 - 공동 glycolic 산 (PLGA)의 electrospun 공사장 공중 발판 biomechanical 특성에 미치는 영향에 대한 세 가지 방법을 비교합니다.

공사장 공중 발판 및 공사장 공중 발판 세포에 의해 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질의 생산 평가에서 세포의 이미징이 설명되어 있습니다. 시험 관내에있는 공사장 공중 발판 Culturing 세포는 비계의 강도와 탄성하지만 조직 공학 literatu을 향상시킬 수다시는 세포가 종종 정적 조건에서 배양해 때 적절한 ECM을 생산하지 못하는 것을 보여줍니다. 몇 가지 상용 시스템은 동적 조절 정권 하에서 공사장 공중 발판 배양 세포에 한 수 있다고 사용할 수 있습니다 -. 한 가지 예를은 미디어 내에 채워진 챔버를 기계적 그립 사용하여 개최 공사장 공중 발판에있는 세포에 대한 컨디셔닝 프로그램을 발휘하는 데 사용할 수있는 Bose Electroforce 3,100입니다 ⁴ 2 차원에 제어된 왜곡에 대한 예산 세포 배양 생물 반응기에 대한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 세포가 이러한 조건 하에서 엘라스틴을 생산하도록 유도 수 있도록 보여줍니다. 마지막으로 세포와 함께 또는없이 배양해 가공 공사장 공중 발판의 biomechanical 특성 평가가 설명되어 있습니다.

프로토콜

1. 랜덤 정렬 Fibres의 Electrospinning

Electrospinning는 earthed 수집기 향해 폴리머 솔루션을 그려 전위를 사용하여 미세 섬유 네트워크를 만듭니다. 수집은 매우 다양한 형태로 사용할 수 있으며 정적 또는 더 일반적으로, 회전이 될 수 있습니다. 솔루션 전에 용매 증발은 수집기에 도착하고 제트기가 섬유로 굳은.

각 고분자는 섬유의 주어진 유형을 생산 조건 자체 집합이 필요합니다. 고분자의 농도는 용매, 펌핑 솔루션 및 earthed 수집기, 둘 사이의 전위차 사이의 거리는 회전 수집기, 유량, 온도 및 습도의 속도는 모든 electrospinning에 영향을줍니다. 여러 매개 변수를 electrospinning의 선택을 설명하는 연구 방법과 생산 공사장 공중 발판 (예 : 섬유 직경, 형태, 및 방향)에서 이러한 영향. ^{5, 6, 7, 8이있다}이러한 실험에서는 공사장 공중 발판은 우리의 이전 연구에서 선택한 조건에 근거 돌다가되었다. ^{2, 9}

다음 방법은 그림 1에서와 같이 회전 수집기를 이용하여 PLGA, 폴리 젖산 (괞찮아), 폴리 ε-caprolactone (PCL)과 폴리 하이드 록시 - 공동 hydroxyvalerate (PHBV)에서 electrospun 공사장 공중 발판의 생산에 적합합니다. 용매 dichloromethane에 걸쳐 (DCM)이 사용됩니다. 여기서 방법은 마이크로 크기의 구슬 ( '진주 목걸이'형태)로 microfibrous PLGA, 괞찮아 및 PCL 및 nanofibrous PHBV 발판을 생산하고 있습니다.

1. 코트 바깥쪽을 향하게 광택 / 광택 측면과, 알루미늄 호일로 심봉 수집기를 도는 것을 볼 수 있었다. 우리 심봉은 20cm 폭이었고, 직경 10cm.
2. 폴리머 솔루션을 준비, 괞찮아, PCL 및 PHBV는 DCM에서 10 wt %의 솔루션으로 구성됩니다. PLGA는 DCM에서 20 wt %의 솔루션으로 구성되어 있습니다.
3. 주사기 펌프 5 ML 볼륨의 장소 4 주사기합니다. 주사기는 C로로드됩니다총 20 ML을 부여 폴리머 각각의 5 ML을 ontain.
4. 괞찮아 들어, PCL 및 PHBV는 주사기 40 μLmin ^-1의 유량을 사용합니다.
5. PLGA의 경우 주사기 30 μLmin ^-1의 유량을 사용합니다.
6. 괞찮아 들어, PCL 및 PLGA는 바늘 끝에서 심봉에 17cm의 작동 거리를 사용합니다.
7. PHBV 들어 심봉에 바늘 끝에서 10cm의 작동 거리를 사용합니다.
8. 알루미늄 호일 코팅 심봉 진입 적절한 거리에서 17,000 V (73,030 P, Genvolt, Shropshire, 영국)과 electrospin에 주사기 바늘을 부과합니다.
9. 무작위 섬유는 200 rpm으로 심봉를 회전 때문이다.
10. 정렬된 섬유의 경우 1,000 rpm으로 심봉을 돌린다.
11. 공사장 공중 발판은 건조 조건 하에서 알루미늄 호일에 저장할 수 있습니다. 추천 스토리지 건조의 존재 4 ° C에서 밀폐 용기에 있습니다. 우리의 경험에서는 공사장 공중 발판은 (우리가 어떤 PU는 깨닫지 못하 이러한 조건 하에서 최소 4 개월 (어쩌면 더)에 대해 안정 유지공사장 공중 발판을위한 장기 보관 조건)에 blished 연구.

2. 선형 스피닝에 의한 복합 공사장 공중 발판 생산

연속 회전이 두 속성의 최상을 가진 재료를 만드는 다른 물질의 속성을 결합하는 방법을 제공합니다. 괞찮아 또는 PCL 스피닝은 저밀도 탄성 시트를 생산하는 반면, PHBV는 평평 농밀 해지고, 취성 시트를 생산하고 있습니다. 두 물질은 세포 부착을 지원합니다. 연속적으로 탄성은 고밀도 셀 - 스며들지 막에서 이러한 자료 결과를 회전.

1. PHBV 방적 조건으로, 제 1 회로 electrospinning 장비를 설정합니다.
2. 위와 같이 Electrospin PHBV.
3. 그 중합체 (예 : 17cm가 바늘로 드럼, 17,000 V, 괞찮아 200 RPM)에 대해 매개 변수와 정상적인 조건을 사용하여 electrospin, 두 번째 폴리머상의 상단을 알루미늄 호일을 변경하지 않고. 이러한 첨가제 과정 이중층을 생산하는 발판의 더블 레이어를 만듭니다.

3. 함께 여러 레이어 어닐링에 의한 Multilayered 공사장 공중 발판 생산

1. 공사장 공중 발판은 어닐링 가열의 사용을 통해 multilayered 수 있습니다. PLGA의이 4 매 서로의 위에 배치되는 작업을 수행하려면 다음 3 시간 동안 60 ° C에서 annealed 열정.
2. 공사장 공중 발판도 증기가 어닐링에 의해 annealed 수 있습니다. PLGA의 여기 네 시트는 서로의 상단에 배치하고 1 시간 동안 DCM의 풀 위에 2cm (10 ML)를 중지합니다. 이것은 상온에서 밀폐된 용기에 수행됩니다.

4. Electrospun 공사장 공중 발판의 무균 생산 및 Postproduction의 Sterilisation

1. 무균 발판 생산은 깨끗한 실내 환경 내부 층류 후드의 무균 환경에서 electrospinning에 의해 형성될 수 있습니다. 의료 학년 또는 DCM에서 배양하여 멸균 폴리머의 어느 멸균 고분자가 사용될 수있는 일을합니다. 일단 해산, 고분자과 같이 감싸 살균 호일에 electrospun있다심봉을 terilised. 공사장 공중 발판 그때 무균 처리됩니다. 불임은 해당 기간 동안 항생제없는 성장 매체 비계의 샘플을 잠복기에 의해 확인됩니다.
2. 에탄올 소독의 경우 (이것은 실험적으로 사용하지만 병원으로 이송 수있는 살균의 인정 방법론되지 않습니다) 공사장 공중 발판은 증류수에있는 에탄올의 70 % V / V 솔루션 (15 분) 간단히 배치됩니다. 실질적인 실험을 위해 이것은 대개 그들이 그때 교양 세포가 성공적으로 결합될 수 있도록 공사장 공중 발판을 소독하기 충분합니다.
3. 셀림 외에 설명된대로 peracetic 산성 살균 공사장 공중 발판을 보려면 peracetic 산성에 포장되어있다 (0.1 %는 V / V 인산에 (PBS) 식염수를 버퍼)과 실온에서 3 시간 동안 incubated. ⁹
4. 감마의 경우 살균 공사장 공중 발판이 셀림 외에 설명된대로 세슘 소스를 사용하여 3 kGy의 선량으로 반구있다 ^9.

5. 공사장 공중 발판의 Biomechanical 테스트

1. 공사장 공중 발판은 직사각형으로 절단되어 5mm 마이크로 미터를 사용하여 두께를위한 측정 및 Bose Electroforce 3,100 악기에 배치 X 20mm. 이 기계는 6mm와 플롯 응력 / 변형율 곡선과 같은 하중 대 변위의 변위에 0-22 N의 힘으로을 적용합니다. 이것은의 영 계수와 탄성 계산 수 있습니다.

6. 공사장 공중 발판 셀을 Visualising 및 ECM 생산을 평가

세포 하나가 그들이 첨부로 공사장 공중 발판 세포를 볼 마이 그 레이션하고 분아 따위에 의해 중식 있도록 필수적인 형광 염료 물들일 수있다. 게시물 문화 공사장 공중 발판 세포의 존재는 4 ', 6 diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)로 세포 핵에 대한 더럽히는 것에 의해 결정됩니다. 발판에있는 세포에 의해 ECM의 생산이 예제와 같이 엘라스틴을 포함하여 ECM 단백질의 범위에 대해 세포를 더럽히는 것으로 평가 할 수 있습니다. 사용된 모든 공사장 공중 발판은을 가지고 측정했습니다1.5 cm X 1.5 cm 사전 시딩에 사각형으로 최소 0.2 mm와 컷의 두께.

이러한 연구에서 인간 피부 섬유아 세포가 있기 때문에 저희 연구실의 주요 연구 분야는 그들이 연조직 재건에서 재생 역할에 걸쳐 사용됩니다.

세포는 유방 감소 또는 abdominoplasty (동의가 연구 목적으로 사용될 자신의 조직을 위해 주어졌다)의 선택 수술을받은 환자에서 피부 샘플에서 얻은됩니다. 휴지를 모으고 연구 조직 은행 허가 12,179하에 익명으로 사용됩니다. 조직은 PBS가 들어있는 스트렙토 마이신 (0.1 밀리그램 / ML) 및 페니실린 (100 IU / ML)과 amphotericin B (0.5 μg / ml) 쇼핑과 함께 씻어있다. 조직 샘플은 0.1 % W / V 트립신과 PBS의 0.1 % 포도당 (12~18시간, 4 ° C)에서 incubated됩니다. 진피는 해제 벗겨 잘게 다진 및 collagenase 10 ML (0.5 % W / DMEM에서 V와 10 % FCS, 37 ° C에서 18 시간 동안)으로 incubated합니다. 결과 세포 suspens의 원심 분리이온 (10 분 400 G는) 소태아 혈청 (FCS 10 % V / V), 스트렙토 마이신 (0.1 밀리그램 / ML), 페니실린 (100 IU /로 보충 배양해과 DMEM에 subcultured 수있는 세포 펠렛을 생산 ML)과 amphotericin B (0.5 μg / ml) 쇼핑. 통로 4-9만이 섬유아 세포는 실험에 사용됩니다.

1. (EasyFlask, Nunc, 뉴욕, 미국) T75에 처음 합류 인간 피부 섬유아 세포가에서 5 분 잠복기, 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 (5 ML, 5 밀리그램 / ML 트립신, 2 밀리그램 / 염분의 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))를 추가하여 놓는 있습니다 37 ° C. 서스펜션은 10 분 (150g)에 centrifuged됩니다. 세포는 DMEM 5 ML (FCS (10 % V / V), 스트렙토 마이신 (0.1 밀리그램 / ML), 페니실린 (100 IU / ML)과 amphotericin B (0.5 μg / ml) 쇼핑과 보완)에 resuspended와를 사용하여 집계됩니다 혈구계, 그리고 농도는 시딩 위해 조정됩니다. 세포가 정상적으로 잘 인당 50,000 세포에 놓는됩니다.
2. 필요한 경우에는 사전에 발판에있는 세포를 퍼뜨리고에, 세포는 빨간색이나 녹색 CellTracker를 사용하여 사전에 분류 될 수 있습니다. 세포의 3 × 5 ML PBS로 씻어 있습니다. 혈청 무료, 37시 (10 ml) 쇼핑은 매체, 휴대에 적합한 추가되고 세포가 45 분 동안 incubated있다 ° C. 10 밀리미터 CellTracker의 솔루션 배양 후 세포는 그들이 공사장 공중 발판 위에 놓는되는 3 × 5 ML PBS의 다음에 씻어 있습니다. 620 nm의 λem (CellTracker 빨간색)과 480 nm의 λex - - 533 nm의 λem (CellTracker 녹색)이 공사장 공중 발판의 표면은 570 nm의 λex에서 축삭의 ImageExpress 현미경 (분자 디바이스, 서니 베일, 미국)에서 몇 군데 수있는 다음. 깊은 공사장 공중 발판으로 multiphoton 공촛점 현미경을 사용할 수있는 세포의 침투를 조사합니다. 이것은 세포 여부에 상관없이 대부분의 공사장 공중 발판으로 200 마이크론 침투력을 주위에 얻을 수 있습니다.
3. 게시 문화 샘플은 20 분 동안 37 ° C에서 PBS 1 ML 3.7 %의 포름 알데히드에 고정 후 3 × 1 ML PBS로 씻어 있습니다.
4. 엘라스틴 일차 항체 200 μL은 각 샘플에 추가 (5 % V / PBS에 V, 토끼 안티 인간 알파 elas있다주석, AbDserotec, Kidlington, 영국)와 30 분 동안 37 ° C에서 incubated.
5. 샘플은 3 × 1 ML PBS로 씻어 후 이차 항체 용액 (0.5 % V / V 염소 항 토끼 IgG (FC) : FITC)에 incubated되어 30 분 PBS 함유 DAPI (1 μg / ml) 쇼핑 인치
6. 그 후 샘플은 3 × 1 ML PBS로 씻어 있습니다.
7. DAPI와 480 nm의 λex 위해 460 나노미터 λem - - 이차 항체에 대한 533 나노미터 λem DAPI 및 보조 항체 스테인드 샘플은 다음 축삭 ImageExpress 형광 현미경, 365 nm의 λex에 몇 군데 있습니다. DAPI은 얼룩 핵 것이 '한 아주 쉽게 섬유 내에서 세포의 분포를 볼 수 있습니다.

7. Biaxial 동적 컨디셔닝으로 공사장 공중 발판 쓰는 셀

fibroblast의 ECM 생산에서 동적 조절의 효과를 조사하기 위해 우리는이를 탐험하는 간단한 Proof-Of-Concept, 개념의 생물 반응기를 개발하였습니다.

1. 풍선과 흐름을 조립그것이 코팅되면 규제 장치와 시스템 준비를 너무 그것은 쉽게 세포 배양에 적합한 무균 용기에 배치될 수 있습니다.
2. 풍선 (1 시간 동안 122 ° C, 220 mBar)를 포함하여 장치 압력솥. 우리는 풍선이 부정적인 팽창과 반복을 deflating하여 기능에 영향을주지 않고 autoclaving 생존할 확인할 수 있습니다.
3. 깨끗한 방에서 위에 electrospun 될 위치에 층류 후드에 장치를 풀고.
4. 인산염은 식염수 버퍼로 필요한 면적 (풍선 여전히 문화 선박에 맞게 필요로 기억)에 풍선을 부풀려 및 멸균이 필요하지 않는 장치의 시점에서 전기 지구로 PBS를 연결 (분기 파이프에 탭 3 방향).
5. 정상 방적 조건을 사용하여 풍선쪽으로 Electrospin가 필요한 폴리머, 10cm의 작동 거리를 사용합니다. 비계가 1 시간 건조하도록 허용합니다. '서부 유럽 표준시'섬유 서핑을 준수 정도 '끈적끈적한'입니다이후 분리하지 않고 풍선의 에이스.
6. 멸균 혈관에 풍선을 넣은 세포 배양에 적합한 층류 후드에 옮겨보십시오.
7. 멸균 표면에 혈관과 장소 (배양 접시)에서 풍선을 제거하고 반복적으로 (매 20 초) 배포하기 위하여 20 분 코팅된 풍선쪽으로 세포 현탁액을 (DMEM 5 ML 1 X 10 ⁶ 셀) 피펫 표면 위에 균일하게 세포.
8. 문화 혈관에 풍선을 놓고 미리 따뜻하게 미디어 세포 유형에 적합한를 추가합니다.
9. 주사기 펌프 (켄트 과학, 요정 플러스, 코네티컷, 미국)로 인플레이션 장치를 연결하고 biaxial 팽만을주고 필요에 따라 풍선을 폐의 / 부풀려. 컴퓨터 제어 주사기 펌프는 더 복잡한 팽만 정권을 달성하는 데 사용할 수 있습니다.

8. 대표 결과

다음 그림은 기대할 수 대표 결과입니다위의 방법대로한다면.

Electrospinning은 무작위 및 명령 구조 (그림 1)과 공사장 공중 발판을 만들어 활용할 수 있으며, 이것은 반복 가능하고 섬유 균일입니다. 폴리머의 많은 종류가 상당히 등 PHBV, 괞찮아 또는 PCL 위해 그림 2에 표시된 다를 수 특성 electrospun 수 있습니다. Electrospinning는 빛 무성한 공사장 공중 발판이나 고밀도 세포 뚫리지 세포막을 (그림 3 참조) 생산 수 있습니다. 여기에 표시된 모든 공사장 공중 발판은 세포 부착 및 증식을 촉진. 이전 작품은 세포가 적어도 500-600 μm의 깊이까지이 공사장 공중 발판으로 마이그레이션할 수있는 것으로 나타났습니다 괞찮아 ⁹ 평균 섬유 직경은 3 μm의이다;. PHBV 위해서는 5-20 μm의에서부터 진주와 0.3μm이다;에 대해 PCL 그것은 3 μm의이다;와 PLGA를 위해 11 μm의입니다. 다른 용매 시스템을 사용하여 다른 연구 PHBV은 구슬이나 폴리머 진주없이 섬유와 같은 electrospun이 될 수 있다고보고합니다. ^10,11

두꺼운 공사장 공중 발판이 수증기 필요하고 어닐링 가열합니다 (그림 4 참조) 함께 공사장 공중 발판의 레이어를 어닐링하는 고용 수있다면. 이 비계 층은 delaminate하지 않으며 그것은 레이어 사이의 접합을 찾기 위해 매우 어려울 수 있습니다.

우리는 세포와 B는 각각 그림 5와 같이 intermingling하지 않고 별도의 멤브레인에서 배양해 할 수있는 이중층 세포막이 이루어질 수 있는지 보여줍니다. 여기서 우리는 두 개의 서로 다른 형광 세포 추적기 염료로 착색된 인간 피부 섬유아 세포를 사용하여이 작업을 보여줍니다. culturing 세포 등 갈라진 구개 수리 또는 치주 재건과 같은 다른쪽에 소프트를 형성하기위한 세포에서 분리된 한쪽에 같은 뼈 또는 연골과 같은 단단한 조직 (일반적으로 빠르게 성장하고있는) 조직을 형성했을 때 이러한 이중층 막가 더 있으면 좋을 텐데 수술. ^{12, 13}

electrospun에 대한 살균의 영향과 관련하여 우리가 가지고 공사장 공중 발판이전 비계와 후속 세포 배양에 대한 살균 영향의 방법 ^9.는 이것은 섬유 직경 궁극의 인장 강도와 PLGA 발판의 영률에 peracetic 산, 감마 방사선 및 에탄올의 영향을 보여주는 그림 6에 설명된 것을보고 .

peracetic 산성과 에탄올은 약 50 % 섬유 직경을 줄이고 반면 감마 방사선은 섬유 직경에 아무런 큰 영향을 미치지 않습니다. 궁극의 인장 강도와 관련하여 살균의 방법의 각각 최고의 인장 강도와 공사장 공중 발판의 탄력을 바꾸었습니다. 이 공사장 공중 발판 세포의 문화는 더욱 궁극적인 인장 응력을 감소하지만, 탄력을 증가했다.

마지막으로, electrospun 공사장 공중 발판을 배양해 세포의 동적 biaxial 팽만의 효과를 테스트하는 방법이 제공됩니다. 이 Proof-Of-Concept, 개념의 접근 방식은 세포 다이나믹 동안 유력한 남아 것으로 나타났습니다팽만뿐만 아니라 이러한 조건 하에서 엘라스틴의 증가 금액을 생산하고 있습니다. 이것은 동일한 발판에 동일한 세포 (그림 7 참조) 정적 조건에서 유지 관리됩니다 엘라스틴의 부족으로 현저하게 대조.

그림 1. electrospinning 장비의 서로 위에 놓여 섬유의 랜덤 및 병렬 섬유 후 레이어 회전의 만화를 표시합니다. 수직 섬유, 알루미늄 호일 위에 정렬된 섬유의 집합을 electrospinning 90 포일를 회전 ° 후 즉시이 위에 정렬된 섬유의 두 번째 세트를 electrospinning에 의해 만들 수 있습니다.

그림 2. () 괞찮아 (스케일 바는 100 μm의 것입니다), (B) PHBV (스케일 바는 100 μm의 것입니다), (C) PCL (스케일 바는 무작위 electrospun 매트의 형태를 표시 100 μm의)와 (D) PLGA (눈금 막대가) 200 μm의입니다. 괞찮아, PCL 및 PLGA 모든 microfibrous 균일한 공사장 공중 발판하다는 점을 염두에 두십시오. PHBV는 5-20 μm의 크기의 구슬을 연결 nanofibres있는 '진주 목걸이'으로 돌다가있다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 3. multilayered 발판 생산. 여기 공사장 공중 발판은 처음 PHBV 후 괞찮아 또는 PCL 가득 주사기가 사용됩니다를 사용 소용됩니다. 이러한 PHBV 발판 위에 소용됩니다. 그림은 울창한 nanofibrous를 보여주는 이러한 multilayered 공사장 공중 발판의 모양 () 단일 PHBV 층, PHBV-괞찮아 이중층의 (B) 단면을 보여주고, '진주 목걸이'PHBV 레이어 (왼쪽)와 더 개방 microfibrous 괞찮아 레이어 (오른쪽)와 (C) 단일 괞찮아 계층.NK "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 두껍게 공사장 공중 발판은 열기가 풀림과 증기가 어닐링에 의해 생산 가능합니다. (A)와 (B) 약 150 μm의 초기 섬유 공사장 공중 발판이 함께 배치되어 있고 dichloromethane 기상이 500 μm의 최대 훨씬 두꺼운 공사장 공중 발판을 만들기 위해 사용되는 증기 annealed 괞찮아 발판을 통해 섹션을 보여줍니다. 에서 (C)와 (D) 한 발판이 함께 얇고 두꺼운 섬유의 레이어를 어닐링 가열하여 만든 얇은 섬유 층과 interspersed 훨씬 두꺼운 섬유 층으로 구성되어 있다고 볼 수 있습니다. 이 접근법은 복잡한 기계적 성질의 공사장 공중 발판을 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

Fi를 gure 5. 이중층 발판에있는 세포의 모습. 모든 경우에 세포가 현재의 인간 피부 섬유아 세포입니다. () 세포를 DAPI로 고정되어 묻은 게있다 electrospun 괞찮아에서 섬유아 세포. PHBV에서 (B) DAPI 스테인드 세포. 년 (C) 섬유아 세포가 중요한 염료, CellTracker 녹색과 사전 스테인드이며, 당신은 이중층의 괞찮아 측면에서 그들의 모습을 볼 수 있습니다. (D) 상위 괞찮아 표면의 낮은 PHBV 표면과 초록색 스테인드 섬유아 세포에 빨간색 스테인드 섬유아 세포와 이중층을 통해 절을 참조하십시오. (E) 사전 스테인드 CellTracker 빨간색과 섬유아 세포는 PHBV 표면에 성장. 중요한 형광 염료의 사용은 세포가 계속 성장하는 동안 발판에서 세포의 분포를보고 편리한 방법을 제공합니다. 하나는 정기적으로 최소 7 일 동안이 염료를 사용할 수 있습니다. 세포가 분열 그러나 염료의 농도가 희석된다. 스케일 바는 0.1 mm로 동일하다.

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그림 6. electrospun 비계의 Biomechanical 속성 Bose Electroforce tensiometer 장치 ()를 사용하여 얻을 수 있습니다. PLGA의 (B) 응력 / 변형율 곡선은 감마 방사선, 알코올, peracetic 산성, 또는 무균 생산 소독 공사장 공중 발판. 궁극적인 인장 응력 (UTS)는, 궁극적인 인장 응력과의 영 계수가 깨지기 전에 섬유 기초 수로 : 세 가지 성능은 같은 그래프에서 얻을 수있다. 후자는 비계의 탄성 나타냅니다. (C) μm의에서 PLGA 섬유 직경의 각 살균 방법의 효과. 각각의 살균 방법은 UTS 감소. peracetic 산성 및 감마 방사선 모두가 더욱 탄력을주는 비계의 영 계수를 감소, 알코올은 비계가 특히 취성 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 7.이 그림은 공사장 공중 발판 (그리고 공사장 공중 발판 내에서 성장하는 세포)가 시간의 기간 동안 biaxial 팽만 들어서는 수있는 biaxial 생물 반응기를 제공하는 간단한기구의 사용을 보여줍니다. () deflated 풍선 electrospun 섬유, PHBV가 입금되어있는에. 이 단계 에선 풍선은 부분적으로 섬유로 덮혀 있습니다. (B) 풍선은 완전히 PHBV와 괞찮아 섬유로 코팅. (C) 세포 현탁액은 반복적으로 풍선에 pipetted있다. (D) 풍선이 주사기 펌프와 PBS (지휘 전해질로 사용)에 연결되어 살균 미디어 병 안에 배치 풍선은 부드럽게 부풀게하고 프로그램된 일정에 대한 풍선의 수축을 허용하는 데 사용됩니다. (E)와 같이 세포 생존을 위해 실시 실험 및 분석의 끝에 풍선에서 제거되는 공사장 공중 발판 세포 (F) 실행 가능한 세포가 진한 파란색 색상을 개발할 수있는 대사 산업사를 사용하여icator 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium 브로마이드. (사) 정적 조건에서 배양해 동일한 비계 (H)에서 동일한 세포가 무시할 수 엘라스틴 생산을 할 수 있지만 세포 (파란색)은이 풍선과 biaxial 팽만에 따라 엘라스틴 섬유를 (녹색, 엘라스틴 특정 항체를 사용하여 스테인드) 개발에 배양해 것을 보여줍니다 . 스케일 바 0.025 mm로 동일하다.

토론

Electrospinning은 조직 공학을위한 공사장 공중 발판을 생산을위한 매우 인기있는 기술입니다. ^{14, 15, 16} 그것이 기술은 또한 복잡하고 다양한 변수와 다각입니다 실험적 사용하기 위해 기본적인 electrospun의 공사장 공중 발판을 만들어 상대적으로 간단하지만. ^6은 어떻게 설명하는 많은 연구가있다 매개 변수를 결정 electrospinning 발판이 생산. 본 연구에서는 초점은 적절한 아키텍쳐 및 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리 락트 - 공동 glycolic 산	시그마 알드리치
폴리 젖산	시그마 알드리치	81,273	고유 점도 ~ 2.0dl / G
폴리 ε-caprolactone	시그마 알드리치
폴리 하이드 록시 - 공동 hydroxyvalerate 12시 1분	Goodfellow	578-446-59	PHB88/PHV12
Dichloromethane	시그마 알드리치 또는 피셔	270,997 또는 D/1850/17	> 99.8 % 50-150ppm amylene의 안정기를 포함
50 멀티 컬러 풍선	윌킨슨의 하드웨어 상점 (주)	0,105,790
염소 항 토끼 IgG (FC) : FITC	AbDserotec	STAR121F
토끼 반 인간 알파 엘라스틴	AbDserotec	4060-1060
스크류 캡 GL45 PP 2 포트, PK / 2	SLS	1,129,750
4 ', 6 Diamidino-2-phenylindole의 dihydrochloride	시그마 알드리치	32,670
CellTracker 녹색 CMFDA	Invitrogen	C7025
CellTracker 빨간색 CMTX	Invitrogen	C34552