電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

要約

我々は、迅速な菌の検出および同定のための電気化学センサの測定方法を説明する。アッセイは、リボソームRNA（rRNAの）種特異的配列のためのDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブで官能化されたセンサアレイを含む。捕捉プローブと西洋ワサビペルオキシダーゼ連動DNAオリゴヌクレオチドの検出プローブでターゲットのrRNAのサンドイッチハイブリダイゼーションは、測定電流測定電流を生成する。

要約

電気化学センサが広く血糖の迅速かつ正確な測定のために使用され、検体の多種多様な検出のために適合させることができる。電気化学センサは、有用な電気信号に生体認識イベントに形質導入​​することによって動作する。シグナル伝達は、電流測定電極に酸化還元酵素の活性を結合することによって起こる。センサの特異性は、酵素の固有の特性、グルコースセンサの場合、グルコースオキシダーゼ、又は酵素及び抗体又はプローブ間のリンケージの積である。

ここでは、直接細菌を検出し、識別するための電気化学センサの測定方法を説明する。いずれの場合も、ここで説明するプローブは、DNAオリゴヌクレオチドである。この方法は、標的リボソームRNA（rRNAの）とキャプチャーと検出プローブのサンドイッチハイブリダイゼーションに基づいています。検出プローブがhに連結されている間に捕捉プローブは、センサー表面に固定されているorseradishペルオキシダーゼ（HRP）。例えば、3,3 '、5,5' - テトラメチルベンジジン（TMB）などの基板は、その表面に結合した捕捉対象検出器複合体を有する電極に追加されると、基板は、HRPにより酸化され、作用電極によって低減される。電極で電流の流れを作り出す、電極からHRPに基板による電子の往復でこの酸化還元サイクル結果。

概要

細菌の検出および同定のための標的分子としてのrRNAを使用すると、多くの利点を有する。細菌細胞内のrRNAの存在量が標的増幅¹を必要とせずにミリリットルあたり250バクテリアの低感度限界のために用意されています。細菌のリボソームRNAは、DNAプローブとのハイブリダイゼーションにアクセス可能なユニークな種特異的な配列を含む。これにより、電気化学センサのアレイは、各センサが異なる種特異的捕捉プローブで官能化されている未知の細菌を同定するために用いることができる。ポジティブコントロールセンサーは、 "ブリッジ"捕捉および検出プローブが内部校正信号を作成するために合成オリゴヌクレオチド標的のために含まれるべきである。

電気化学センサーは、基本的な研究および翻訳の幅広い用途を有する。例えば、ここに記載されたアッセイを正確E.の効果を測定するために使用されているRRN上の大腸菌増殖期細菌の生理学²に興味を持って研究者に大きな関心であると事前rRNAのコピー数、。電気化学センサアッセイの感度は、信号対雑音比によって決定される。信号増幅及びノイズ低減の様々な方法が検討されている。私たちは、センサー表面の化学的性質を改善することは検出プローブおよび/またはHRP酵素の非特異的結合を減少させるための鍵であることがわかります。特に、アルカンジチオール及びメルカプトヘキサノールとの混合単分子膜は、標的ハイブリダイゼーション³に対して捕捉プローブのアクセス可能性を保持しながらより完全に電極表面を被覆することによってバックグラウンドを低減することが見出された。これらの表面化学処理は、複雑な生物学的サンプルを伴うアッセイのために特に重要である。

プロトコル

1。電気化学センサーの機能化

1. 300μMの1,6 - ヘキサン（HDT）、10mMのトリス-HCl、pH8.0、0.3 MのNaCl、1mMのEDTA、10分間、室温で暗所でインキュベートにおいて0.05​​μMの濃度でチオール化捕捉プローブを準備。 HDTを有するチオール化捕獲プローブのインキュベーションは、より一貫性のある結果をもたらし、捕捉プローブのチオール基が低減されることを保証する。
2. 水分および/または粒子を除去するために5秒間裸金16センサアレイチップ（複数可）に窒素気流を適用する。
3. HDT-チオール捕捉プローブの6μlのセンサアレイのすべての16のセンサーの作用電極に混合し、4℃で一晩カバーペトリ皿にセンサーチップ（s）を保存し適用します。チオール捕捉プローブは、裸の金電極に直接結合し、HDTは、捕捉プローブの過剰充填防止し、それらの目標とのハイブリダイゼーションを促進し、拡張コンフォメーションを保つように作用する。
4. ザ翌日、5秒間、窒素気流下で2〜3秒で乾燥し、脱イオンH ₂ Oとセンサチップを洗う。
5. 10mMのトリス-HCl、pH8.0、0.3 MのNaCl、1mMのEDTA、1mMの全てのセンサ16と50分間インキュベート作用電極に6 - メルカプト-1 - ヘキサノール（MCH）6μlのを適用する。これ以降のすべてのセンサチップインキュベーションを室温で覆われたペトリ皿で​​行われる。 MCHは、チオール捕捉プローブまたはHDTは、電極表面上に存在しない任意のギャップを埋める、ブロッキング剤として機能します。

2。試料調製

1. 5分間16,000 xgで遠心チューブと遠心分離機に成長の対数期（≈0.1 OD _600）で細菌培養液1mlを転送します。培養上清を取り除きます。細菌ペレットを直ちに処理または-80°C、後で使用するために保存することができる。
2. 徹底的にボットにピペットチップを適用することにより、1MのNaOH10μlに細菌ペレットを再懸濁マイクロチューブのトムと数回ピペッティング。 5分間室温で懸濁液をインキュベートする。
3. ウシ血清アルブミン（BSA）およびフルオレセイン変性検出プローブの0.25mMの2.5％を含有し、pHが7.2、1 Mリン酸緩衝液50μlを添加して細菌溶解物を中和する。室温で10分間中和された溶解物をインキュベートする。フルオレセイン変性検出プローブは、細菌リボソームRNA標的分子とハイブリダイズする。

3。電気化学センサーアッセイ

1. 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH ₂ OとのセンサーチップからMCHを洗ってください。
2. 14センサーのそれぞれの作用電極に中和細菌溶解4μlのを適用し、15分間インキュベートする。標的検出プローブ複合体は、固定されたチオール化捕獲プローブにハイブリダイズする。
3. 2.5％BSAおよび0.25＆を含む1Mのリン酸緩衝液中でオリゴヌクレオチドを​​ブリッジ1nmの4μlを、pHが7.2を適用μ、Mフルオレセイン変性検出プローブ2陽性対照センサ（信号正規に使用される）と15分間インキュベートする。
4. 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH ₂ Oとセンサチップを洗ってください。
5. 15分間のすべての16のセンサーとインキュベートの作用電極に0.5％カゼインを含む1 Mリン酸緩衝液で0.5 U / mlの抗フルオレセイン-HRP4μlの、pHが7.2を適用します。抗フルオレセイン-HRPは、固定化されたフルオレセイン修飾された検出プローブに結合する。
6. 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH ₂ Oとセンサチップを洗ってください。
7. センサーチップマウントにセンサチップと負荷の表面によくフィルムステッカーを適用します。全16センサーへのTMB基質のピペットを50μlとセンサチップマウントを閉じます。
8. ヘリオスチップリーダーを使用しているすべての16センサー用アンペロメトリーとサイクリックボルタンメトリー測定値を得る。電流測定電流は、TMB、rの速度に比例しているセンサー表面に析出（ 図1参照）。

結果

私たちは、サンドイッチELISAと同様に構成されている電気化学的測定法について説明します。 図1に示すように、捕捉および検出プローブと標的リボソームRNA（rRNAの）ハイブリダイゼーションを検出プローブ上の3 'フルオレセイン結合に結合する抗フルオレセイン抗体フラグメントに結合したHRPにより触媒される酸化還元反応によって開発されている。分析感度の重要な構成?...

ディスカッション

ここで説明する電気化学センサアッセイは、核酸標的の迅速な検出を可能にする。感度および特異性は、順番に長さ及び捕捉および検出プローブのGC含有量に依存するターゲットプローブハイブリダイゼーションの自由エネルギーに部分的に依存する。我々は一般的に、周囲温度^{（〜20℃）5、6}でのハイブリダイゼーションの手順を実行します。チップを含有する被覆チャンバ内に配?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.