Congelar las células madre embrionarias humanas

Resumen

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se congela HUES de embriones humanos líneas de células madre.

Resumen

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se congela HUES de embriones humanos líneas de células madre. Una cultura saludable, en expansión exponencial se lava con PBS para eliminar los medios de comunicación residual que podrían detener la reacción de tripsina. Calentado 0,05% de tripsina-EDTA se añade a la cubierta de las células, y la placa se deja incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo las células se puede observar el redondeo, y las colonias de elevación de la superficie de la placa. Pipeteo suave repetida eliminar las células y colonias de la superficie de la placa. Las células con tripsina se colocan en un tubo cónico estándar contiene pre-calentado los medios de comunicación celular hES para saciar la tripsina restante, y se dio entonces. Las células se resuspenden los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente un millón de células en un ml de los medios de comunicación, una concentración tal que una alícuota congelada es suficiente para resucitar a una cultura en una placa de 10 cm. Después las células se volvieron a suspender adecuadamente, los medios de comunicación de hielo frío se añade al mismo volumen. Las suspensiones celulares se mezcla bien, alícuotas en viales de congelación, y se permite que se congelen con lentitud a-80C durante 24 horas. Las células congeladas se pueden mover a la fase de vapor de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo, o mantenerse a -80 durante aproximadamente seis meses.

Protocolo

1. Una cultura saludable, en expansión exponencial se lava con PBS para eliminar los medios de comunicación residual que podrían detener la reacción de tripsina.
2. Calentado 0,05% de tripsina-EDTA se añade a la cubierta de las células, y la placa se deja incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo las células se puede observar el redondeo, y las colonias de elevación de la superficie de la placa.
3. Pipeteo suave repetida eliminar las células y colonias de la superficie de la placa.
4. Las células con tripsina se colocan en un tubo cónico estándar contiene pre-calentado los medios de comunicación celular hES para saciar la tripsina restante, y se dio entonces.
5. Las células se resuspenden los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente un millón de células en un ml de los medios de comunicación.
6. Después las células se volvieron a suspender adecuadamente, los medios de comunicación de hielo frío se añade al mismo volumen.
7. Las suspensiones celulares se mezcla bien, alícuotas en viales de congelación, y se permite que se congelen con lentitud a-80C durante 24 horas.
8. Las células congeladas se pueden mover a la fase de vapor de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo, o mantenerse a -80 durante aproximadamente seis meses.

Nota: una alícuota congelada a una concentración de 106 células / ml es suficiente para resucitar a una cultura en una placa de 10 cm.

Discusión

La técnica se describe para la congelación de las líneas celulares HUES funciona bien para el almacenamiento eficiente y la resurrección de líneas HUES celular y también los de células de mamíferos de interés. Congelación de una pequeña proporción de células en cada paso es una consideración importante cuando se trabaja con líneas celulares de HES, como alteraciones del cariotipo pueden surgir y las células anormales pueden apoderarse rápidamente de la línea. Por lo tanto, después de haber congelado se divide en cada paso...

Materiales

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For aq total of 651.5 ml, add: 500 ml KO-DMEM + 6.5 ml PenStrep + 6.5 ml L- Glut + 6.5 ml NEAA 6.5 ml + beta-mercaptoethanol 0.6ul (14.3 M stock) + 65 ml Serum Replacement + 65 ml Plasmanate + 0.65 ml bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulphoxide). Stored at 4C.