Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomografia a coerenza ottica Imaging

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo per creare un assottigliata-teschio finestra corticale (TSCW) in un modello di topo per In vivo Ottobre immagini della corteccia cerebrale.

Abstract

Tomografia a coerenza ottica (OCT) è una tecnica di imaging biomedico ad alta risoluzione spazio-temporale. Con il suo approccio mini-invasivo ottobre è stato ampiamente utilizzato in oftalmologia, dermatologia, gastroenterologia e ^1-3. Utilizzando una finestra assottigliata cranio-corticale (TSCW), ci avvaliamo di spectral-domain OCT (SD-OCT) modalità come strumento per l'immagine della corteccia in vivo. Comunemente, un aperto-cranio è stato utilizzato per neuro-imaging in quanto fornisce una maggiore versatilità, tuttavia, un approccio TSCW è meno invasiva ed è un mezzo efficace per l'imaging lungo termine in studi neuropatologia. Qui, presentiamo un metodo per creare un TSCW in un modello di topo per l'imaging in vivo ottobre della corteccia cerebrale.

Introduzione

Dalla sua introduzione nei primi anni del 1990, ottobre è stato ampiamente utilizzato per l'imaging biologico della struttura dei tessuti e la funzione ^2. Ottobre genera immagini in sezione trasversale misurando il tempo di ritardo dell'eco di ⁴ luce riflessa mediante l'attuazione di bassa coerenza con sorgente di luce a fibre ottiche ^2,4 interferometro di Michelson. SD-OCT, noto anche come dominio di Fourier ottobre (FD-OCT), è stato introdotto nel 1995 ⁵ e offre una modalità di imaging superiore rispetto alla tradizionale dominio del tempo OCT (TD-OCT). In SD-ottobre, il braccio di riferimento viene mantenuto fermo con conseguente alta velocità e ad altissima risoluzione di acquisizione dell'immagine ^6-9.

Attualmente, i modelli TSCW sono stati ampiamente utilizzati in applicazioni per brain imaging in vivo di due fotoni microscopia in luogo di una craniotomia tradizionale. Questi TSCW sono stati utilizzati in concomitanza con un piatto cranio personalizzato o un foglio di copertura in vetro ^10-13 per fornire ulteriori imaging stabilità. Nei nostri studi, abbiamo osservato che gli accessori come questi non sono necessari per l'imaging ottobre quando un TSCW viene utilizzato. Pertanto, la mancanza di una piastra cranio o vetrini di vetro consente una più ampia gamma di dimensioni di imaging finestra in quanto potrebbero interferire con il fascio ottico e modificare immagini ottobre

A assottigliata-cranio preparazione ha dimostrato di essere vantaggioso in studi di imaging del cervello utilizzando due fotoni microscopia ^10-13. Nei nostri esperimenti, ci avvaliamo di un sistema SD-OCT per l'immagine del corteccia in vivo attraverso un TSCW. La nostra misura SD-OCT installazione di imaging contiene una, la banda larga a bassa coerenza sorgente luminosa costituita da due diodi superluminescenti (SLD) centrato a 1295 nm con una larghezza di banda di 97 nm con un conseguente risoluzione assiale e laterale di 8 micron e 20 micron, rispettivamente ¹⁴ . Con il nostro dispositivo di imaging ottico, prevediamo che l'imaging attraverso un TSCW ha un grande potenziale per individuare e visualizzare le strutture e le funzioni in otessuti del cervello ptically denso.

Protocollo

1. Preparazione chirurgica

1. Femmina CD 1 topi di età compresa tra 6-8 settimane sono state utilizzate nei nostri esperimenti.
2. Anestetizzare il mouse con una iniezione intraperitoneale di una combinazione di chetamina e xilazina (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg xilazina). Posizionare il mouse su un tappetino omeotermi per garantire una temperatura ottimale del corpo a ~ 37 ° C. Monitorare costantemente il livello di anestesia testando riflessi dell'animale (ad esempio, pizzicando piedi con una pinza smussati) e iniettare più l'anestesia in caso di necessità.
3. Lubrificare entrambi gli occhi con un unguento lacrima artificiale. Rimuovere i peli sul cuoio capelluto con un rasoio e rimuovere i capelli residui usa il 70% di preparazione tamponi di alcol. Applicare uno strato sottile di crema di rimozione dei capelli Nair sul cuoio capelluto e attendere 2 minuti per esso abbia effetto. Pulire delicatamente via i capelli Nair e rimanente utilizzando tamponi di cotone inumiditi salina e pastiglie di preparazione alcol. Cuoio capelluto dovrebbe ora essere completamente glabro.
4. Disinfezione cuoio capelluto con un bastone betadine tampone e pulire con 70% etanolo preparazione pastiglie.
5. Avvolgete l'animale in teli chirurgici per garantire una temperatura ottimale del corpo di ~ 37 ° C e montare l'animale su un telaio stereotassico per immobilizzare il cranio. Battere leggermente il cranio per garantirne la stabilità. Un elenco di materiali utilizzati sono fornite nella Tabella 1.

2. Diluito-cranio Preparazione finestra corticale

1. Avviare l'incisione nel punto mediano tra gli occhi. Continua caudalmente al punto linea mediana tra le orecchie. Parte la pelle con una pinza.
2. Individuare l'area deve essere diluito con un microscopio da dissezione e rimuovere delicatamente la fascia con una pinzetta. Asciugare il cranio con tamponi di cotone sterili prima di creare la finestra corticale assottigliata. Nei nostri esperimenti, abbiamo creato un 4 × 4 mm diluito cranica finestra ~ 1 mm posteriormente e lateralmente al bregma.
3. Cominci a diventare calvo cranio con un rotondo fresa in carburo di dimensioni punta 0,75 millimetri in un trapano a mano chirurgica utilizzando la luce onl travolgente movimentoy. Non applicare una pressione diretta sul cranio. Interrompere il fresaggio ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere osseo con soluzione salina sterile e tamponi di cotone e per evitare surriscaldamento del cranio. La soluzione salina aiuterà anche a dissipare il calore in tutto il cranio.
4. Una volta che lo strato esterno di osso compatto viene completamente rimosso lo strato centrale dell'osso spugnoso dovrebbe essere visibile. Ci può essere qualche leggero sanguinamento da vasi sanguigni sono più evidenti nello strato osso spugnoso. Passare a una fresa pietra verde e continua che si esercita con cautela come strato spugnoso è più delicata. La fresa pietra verde sarà rimuovere il materiale meno osso creando uniformità in tutta la finestra del cranio. Interrompere il fresaggio di tanto in tanto per rimuovere la polvere delle ossa e per raffreddare il cranio.
5. Infine, quando il cranio è diventato più trasparente e vascolarizzazione del cervello è ora visibile, iniziare la lucidatura del cranio con una fresa di lucidatura. Ciò consentirà una più precisa assottigliamento mentre lisciandosi il cranio. Controllare magrezza del skull picchiettando delicatamente su di esso con una pinza. Arrestare lucidatura quando il cranio diventa leggermente flessibile.
6. La finestra diluito cranica dovrebbe essere completamente liscia e riflettente e pronto per l'imaging (Figura 1). A causa della natura dei tessuti altamente diffondenti del cervello, il cranio deve essere diluito ad almeno 55 micron di profondità di penetrazione ottimale. Un elenco di materiali utilizzati sono fornite nella Tabella 1.

3. Tomografia a coerenza ottica Imaging

1. Dopo l'intervento chirurgico è completa, controllare la frequenza respiratoria dell'animale e riflessi di garantire adeguato livello di anestesia e somministrare l'anestesia supplementari, se necessario. Rimuovere animale dal telaio stereotassico, tenere animale avvolto in teli chirurgici, e degli animali il trasporto alla stazione di imaging.
2. Prima di controllare i segni di imaging per i riflessi e applicare ulteriori lacrima artificiale se necessario. Animale montare sul telaio stereotassico per fissare il cranio.
3. Luogo animale inOttobre fotocamera e la posizione TSCW sotto il fascio ottico (Figura 2). Una vista in sezione trasversale del cranio e cervello può ora essere visualizzati (Figura 3).
4. L'acquisizione dei dati può iniziare un tempo area di interesse si trova. Per scopi di imaging, usiamo specchi galvanometrica per ottenere una finestra di imaging con una larghezza di 4,0 mm. Una profondità di 2 mm di imaging è stato ottenuto con 6 mW di potenza incidente e un punto focale 1 mm sotto il cranio assottigliato. Ogni sezione trasversale costituita da 2.048 scansioni assiali con un tasso di acquisizione di 0,14 sec per immagine.
5. Scansioni volumetriche del cervello può anche essere ottenuta raccogliendo una serie di 2D immagini trasversali mediante due serie di specchi per Galvo xy scansione con il primo specchio galvo scansione del fascio nella direzione sagittale e il secondo specchio di scansione galvanometrica nel coronale direzione.

Risultati

Dopo aver creato una finestra assottigliata sulla corteccia cerebrale vascolarizzazione dovrebbe essere ora evidenziare visivamente (Figura 1) e consentirà una profondità di imaging profondo (fino a 1 mm). La corteccia destra viene diluito a circa 55 micron, rispetto ad un teschio normale misurato a 140 micron (Figura 1) e fornisce maggiore chiarezza ottica. Ulteriori diradamento a 10-15 micron è possibile ¹¹ Non occorre tuttavia che l'uso di vetrini in vetro e piastre...

Discussione

Imaging con OCT e assottigliato-teschio è un romanzo neuro-imaging tecnica che è solo stato recentemente studiato ^{15, 16.} Nei nostri esperimenti, abbiamo dimostrato la fattibilità di SD-OCT immagini attraverso un TSCW in un modello di topo in vivo. Dai risultati ottenuti, il cranio è assottigliata a circa 55 micron e la profondità di penetrazione è ottenuta a circa 1 mm con risoluzione di immagine di 8 um e 20 um in direzione assiale e laterale, rispettivamente. Nel profilo di intensità di seg...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ketamina	Phoenix Pharmaceuticals	57319-542-02
Xylazina	Akorn, Inc.	139-236
Artificial Tears Unguento	Rugby	0536-6550-91
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	4010130
Alcool sterile Prep Pad	Kendall Healthcare	6818
Cotone Tipped Applicatori	FISHERBRAND	23-400-115
Betadine Soluzione Swabstick	Purdue Prodotti	67618-153-01
Soluzione salina, 0,9%	Phoenix Pharmaceuticals	57319-555-08
Stereotassica Telaio	Stoelting
Trapano a mano ad alta velocità chirurgica	Foredom		38.000 rpm
Carbide rotonda Bur	Stoelting		0,75 millimetri
Dura-verdi Pietre	Shofu		Shank: HP Forma: BA1
CompoMaster grossa & CompoMaster Lucidatore	Shofu		Forma: Mini-Pt.
SpaceDrapes	Braintree Scientific, Inc.