の生細胞サイクル分析<em&gt;ショウジョウバエ</em同調させるアコースティック·フォーカスサイトメーターとVybrant DyeCycleバイオレットDNA染色を使用して&gt;組織

要約

生きた細胞周期分析のためのプロトコルショウジョウバエ組織が記載されている。このプロトコルは、同時に系統トレースまたは蛍光タンパク質の組織特異的発現を介して相対セルサイズに関する情報を、細胞数、DNA含量および細胞型を提供する。

要約

フローサイトメトリーは、広く異なる細胞周期の段階で相対的な割合を推測する、細胞集団におけるDNAの内容に関する情報を取得するために使用されている。この技術は、正常インビボにおける細胞周期調節の遺伝学的研究のためのモデル生物キイロショウジョウバエの細胞分裂組織に拡張されている。細胞型特異的蛍光タンパク質の発現および遺伝子操作と結合するとき、いずれかのセル数、セルサイズおよびインビボでフェージング細胞周期に対する影響についての詳細な情報を得ることができる。しかしこの生細胞の方法は、UVレーザーを搭載したフローサイトメーターにユーザーを制限すること、細胞透過性ヘキスト33342-DNA挿入色素の使用に依存してきた。我々は、より一般的なバイオレット405nmのレーザーとの互換性が、新しい生細胞のDNA染料、Vybrant DyeCycleバイオレットを使用するには、このプロトコルを変更した。ここで紹介するプロトコルは、細胞と結合効率よく細胞周期分析を可能にするショウジョウバエ組織の様々なタイプの相対的なセルサイズとセル番号情報。このプロトコルは、単一実験室規模で実行し、維持することができ、小さなベンチトップ·アナライザへのライブショウジョウバエの組織のために有用な細胞周期解析手法、同調させるアコースティックフォーカシングサイトメーターを拡張。

概要

フローサイトメトリーは、細胞生存率、相対的なセルサイズ、DNA含量および生細胞集団における蛍光タンパク質発現の測定に用いることができる。 S相細胞の集団におけるDNAの内容に関する情報中の核DNAの複製のためには、異なる細胞周期相^1-3の相対的な割合を推測するために使用することができる。この方法は、酵母から哺乳動物モデル系における細胞周期分析の基礎となっている。

ショウジョウバエでは、細胞周期調節のin vivo解析で遺伝するための優れたモデルシステムとなっています。ハエで利用可能な大規模な遺伝的なツールは、in vivo蛍光タンパク質ベースの系統で ^4-6トレースとともに細胞周期調節因子の優雅な組織特異的かつ時間的に調節操作が可能になります。フローサイトメトリーendorepl含む、 ショウジョウバエの細胞の種類の数にDNA含量を研究するために使用されている細胞と培養有糸分裂細胞^7,8 icating。 in vivoでの細胞周期の研究における重要な進歩のためには、ライブ二倍ショウジョウバエ成虫ディスク^9,10、多くのラボで使用され、適応されていたプロトコルのフローサイトメトリー分析のためのプロトコルの開発、デ·ラ·クルスとエドガーによって作られた。誘導性蛍光タンパク質の発現および組織特異的標識を介してトレースをインビボ系統の遺伝子と結合この技術は、 インビボ ⁹ のいずれかの全体的な細胞倍加時間、セルサイズに遺伝子操作への影響に関する情報を取得し、細胞周期相の正確なタイミングを決定することができ^、11。しかし、この方法では、これまでユーザーがエキサイティングヘキスト染料のできるUVレーザーでメーターを流れるように制限されている生きた細胞内でDNAを染色し、定量化するための細胞透過性ヘキスト33342-DNA挿入色素の使用に依存してきました。これらは一般のみソーター（ つまり BD FACS Vantaで発見されていGE、BD FACSAria）や高価な多色ベンチトップシステム（ つまり BD LSR）、通常の機関流れ中核施設でサポートを必要とする。

私たちは、インビトロジェン、Vybrant DyeCycleバイオレットから新しい生細胞のDNA染料を使用するヘキストベースのプロトコルを変更した。この染料は、小さな自己完結型のベンチトップ·アナライザ、同調させるアコースティックフォーカシングサイトメーターより小さい卓上型アナライザーに共通および利用可能なバイオレット405 nmのレーザー、互換性があります。ここでは、DyeCycleバイオレットと同調を用いた開発のさまざまな段階でショウジョウバエ組織の様々な細胞型、セルサイズ、セル数および系統解析と結合することができる細胞周期分析のための詳細なプロトコルを提示する。このプロトコルは、 ショウジョウバエ組織を有するそのような分析に適したメーターの数を拡大し、生細胞周期分析のこのタイプは、追加の組織の種類および発達段階のために変更することができる方法の例を提供する。

プロトコル

1。畜産を飛ばす

1. クロスは10ミリリットル酵母グルコース培地³または任意の他のタンパク質が豊富なメディアとの狭いプラスチックバイアルで目的遺伝子型のハエ。 生体蛍光タンパク質発現に使用したトレースの組織特異的発現と系統で利用広範ショウジョウバエ遺伝子導入のツールは他の場所で^4,5詳細に記載されている。 24時間子孫コレクションのシリーズを得るために毎日新鮮なバイアルに両親を転送したり、より正確なステージングのために、寒天プレート上胚を収集し^、10は、上記のようにバイアルに孵化幼虫を移す。実験全体で均一な条件を確保し、過密回避するために、単一バイアル中F1子孫の総数は100を超えてはならない。実験の遺伝的設計に応じて、必要な発達段階になるまで適切なインキュベーターにバイアルを保つ。
2. 実験動物を収集：あなたが^第 3幼虫で成熟した幼虫が必要となります正確蛹ステージング用幼虫の解剖や白前蛹（WPP）の開発のための110-120時間程度で齢（L3）。非増殖状態にスイッチを含む劇的な細胞周期の変化は、変態^12,13間に異なる時点で発生します。したがって蛹（開発の1時間以内）の正しいステージングは​​変態時の再現性の細胞周期のデータのために不可欠です。 WPPは、 図1、パネルIに示す蛹形成（0時間APF）の後に0時間に対応していますいくつかの湿度を維持するために水を2.5mlで濡れ折らキムワイプで35ミリメートルペトリ皿にWPPを収集します。適当な温度で所望の段階（時間APF）まで年齢蛹。開発は29℃で、18時よりゆっくりと2.2倍°C標準の25℃よりも^14°Cを 1.2倍速く進行することに注意してください。
3. ^9,11を必要に応じて、クローンを系譜トレース用熱ショックflipase（HS-FLP）誘発組換えを活性化する熱ショック動物。幼虫の熱ショック、浸すための水浴（37℃に設定）と幼虫を確実にバイアルは完全に水没しています。蛹のヒートショックは、パラフィルムでシャーレを密封し、完全に水槽に沈めるそれを。動物の生存のために十分な酸素交換を可能にするために、熱ショック後にパラフィルムを除去してください。熱ショックの期間はflipaseの使用導入遺伝子と、目的のクローンの数の活性に依存する。我々は日常的にHS-FLP導入遺伝子間に、HS-FLP最初の染色体上に導入遺伝子と35ミリ皿に蛹のヒートショックのために2-4分で幼虫にクローン^15をトレースした系列"FLIPOUT"を誘導するための7-8分を使用第二染色体は20分を必要とします。熱はショッククローンの類似の番号を取得する。

解剖の細胞分裂とタイミングの割合は、各組織でのクローンのサイズを決定します。通常の条件下では、我々はクローンが20分の熱ショック（第2染色体上にHS-FLP導入遺伝子を使用して）dissecと幼虫の翼に誘導されることがわかりテッド48時間後に、クローンごとに4つのセルの周りの平均は、クローンあたり10細胞からのクローンごとに2つのセルに及ぶサイズで約20〜30良好に分離クローンが含まれています。これとは対照的に、0時間APFでシャーレに蛹の同じHS-FLP導入遺伝子で7分の熱ショックは36時間後に解剖し、歩留まり良く平均で1から4セルまでの範囲（約15〜25）クローン分離クローン当たり2.2細胞の。このようなデータは調査中の組織の平均細胞倍加時間を決定するために使用することができる。

2。解剖

1. 優しく1X PBSを含む透明なガラス解剖皿に幼虫/蛹を転送します。
2. 解剖顕微鏡と十分な光を利用して、優しく鋭いイノックス＃5鉗子と腹部で幼虫を把握し、幼虫を保持しながら、マイクロはさみで前方の三分の一をカットし、後方に向かって口領域を内側に押して、前方の三分の一を反転キューティクル着実（ 図1A）。注意深くopaquを削除電子体脂肪や、翼、目や脳など希望する組織の可視性を高めるために、残りの腸。目的の組織を解剖、きれいに口フック、または目（ 図1G）から脳から鉗子、目で気管とキューティクルから翼を取り外す。
3. 蛹を解剖するため、気泡がある場合蛹内側（ 図1C）を損傷しないように、そっと蛹ケースの前方先端で蛹を把握するために鉗子を使用しています。反対の手で鉗子またはマイクロハサミは、適切な把握のために位置フローティング蛹を助けるために使用することができます。きれいマイクロハサミで蛹の後方先端をカット。この断面カットは胸部と頭の中で希望する組織にhistolyzed脂肪を強制することなく、内部の圧力を解放するために、動物の背の部分に向かってわずかな角度で行う必要があります。翼と前眼 - 脳の複雑なを避けて、背側正中に沿って慎重にカットします。慎重に蛹から蛹を取り除く蛹表皮の後部エッジをつかみ、蛹ケース（ 図1D）からそれを引いてケース。ピンセットで目脳複合体にキューティクル前方に小さな穴を突く。ゴム球のガラスパスツールピペットを用いて、優しくhistolyzed脂肪、残り腸組織を除去するために部分的に解剖蛹を通してPBS郭清ソリューションを洗う。これはまた、効果的に保存ガラスピペットの内側に付着解剖組織の発生率を低下させる脂質およびタンパク質、を有するガラスピペットを潤滑する。
4. 蛹の翼を入手するには、翼と翼自体を包むキューティクルは蛹（ 図1E）からこじ開けなければなりません。これはの側からそれを取り除く前にどちらかの翼キューティクルの最も後部先端を把握するために、別の鉗子を使用していて、引き出したり、ヒンジ近くの翼の下に鉗子を操縦しながら1鉗子で頭で蛹​​を押したまま行うことができます死骸（Figure 1E）。翼はその後カットまたは身体からそれを削除して、離れて死体や他の物質からの山に入れてヒンジで引き裂かれることができます。
5. 目脳複合体は外れと蛹（ 図1F、1H）から無料になるまで蛹目や脳を入手するには、蛹を洗う。鉗子を使用して、静かに離れて脳から蛹の目を引いて、所望の組織を保存します。
6. 結果は長い細胞が動物を開いた後、PBSに残っているより少なく正確になるように、それぞれのサンプルを分析するために45分より長く服用しないでください。

3。組織解離とDNA染色

1. 潤滑パスツールピペットを使用して、慎重に5ミリリットルのポリスチレンチューブ（ 図1G）でライブDNA染色液を0.5mlに解剖組織を移す。 DNA染色液にできるだけPBSとして転送（未満300μl）を、トリプシンの希釈として組織解離を阻害する。
2. シャキとチューブをインキュベートNG 23で500回転（我々はエッペンドルフサーモを使用します）℃で。
3. 中速（5の設定）で5秒間軽くボルテックス後、70分間インキュベートする。アンダーボルテックスは細胞塊につながる一方、過度ボルテックスは、細胞破壊やフォーム破片が発生します。速度は5で5秒間もう一度彼らをボルテックスする前に追加、15〜20分間、500 rpmで23℃で振盪にサンプルを返します。
4. 脳と36hAPFより古い蛹の目の場合は、修正されたプロトコルが必要です。 1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに45-60分間、500 rpmで23℃でDNA染色液で組織を解離する。その後、一つずつ手作業で約50μlのDNA染色液と迅速に手動で描かパスツールピペット^16（約100-150μmの開口部の）で上下にピと一緒に解剖皿に転送することによって、組織の大きな塊を解離。 5ミリリットルチューブにDNA染色液0.5mlの残りの部分と各解離標本を転送します。さらに45をインキュベート23℃-30分（総インキュベーション時間の最大90分）°塊が見えなくなるまで500rpmで振盪しながらC。
5. 音符無細胞透明蛹翼キューティクルが解離しないことが完全に解離サンプルは、組織の非常に少数の大きな目に見える塊を持っている必要があります。

4。フローサイトメトリー

1. 同調メーターの電源をオンにし、同調ソフトウェアを開きます。メーターレーザーは起動メニューからオンにする必要があり、毎日の性能試験は、データ収集の各曜日の前に十分なスコアを持つパフォーマンス追跡ビーズを用いて実施されるべきである。流体レベルは少なくとも半分と性能試験の前に空になった廃棄物であるべきである。同調させるの起動、適切なキャリブレーションおよび操作の詳細は同調ユーザーガイド（に記載されていますhttp://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf ）
2. 新しいTEを設計4.3に示されているパラメータを持つ空白のワークスペースに4ドットプロットと2ヒストグラムを作成することによってmplate、または実験に適し以前に設計されたテンプレートを選択し、収集するサンプル数を示す。私たちは、付録IでのライブVybrant DyeCycleバイオレットとGFPとショウジョウバエの細胞周期解析やRFP発現に同調させるテンプレート（。得る形式のファイル）を提供してきた
3. 提供されるテンプレートは、4つのドットプロットと図2に示されているパラメータを持つ2つのヒストグラムが含まれています。検出のためのチャンネルが含まれます：FSCとSSC - セルサイズおよび膜の複雑さ、VL1高さ（H）、幅（W）と面積（）を示す前方散乱と側方散乱 - DyeCycleバイオレット染色の示すバイオレットレーザー励起DNAおよびBL1を- - GFP蛍光を示すブルーレーザーチャンネル1エリア、。 RFP解析のため提供されているテンプレートは、それがoptimiあるブルーレーザーチャネル3（BL3-）、使用することを除けば、GFP分析のためのテンプレートと同じですRFPを検出するためにアルファベットのゼット。
4. テンプレートのドットプロットは、所望の集団を分析を制限すると解析（ 図2）から破片や細胞塊を限定するゲートを有している。ゲート1はSSC対FSC（ 図2A）に基づいて破片や塊を除外します。ゲート2は、シングレット（VL1Area対VL1Width）（ 図2B）の識別に基づいて染色されていない細胞は、サブG1アポトーシス細胞と細胞塊を除外。ゲート3は、ゲート1と2内の細胞を包含、派生ゲートであり、GFP（あるいはRFP）陰性細胞対VL1Height（ 図2C）に基づいてDNA含量を識別します。ゲート4は、ゲート1と2内のセルを包含、派生ゲートであり、GFP（あるいはRFP）DNA含量（ 図2C）対陽性細胞を識別します。 GFP（またはRFP）対前方散乱（FSC）によって測定されるセルサイズのドットプロットは、ゲート5および6（ 図2D）を生成するために使用される。 Y-軸対称にX軸及び細胞数の2つのヒストグラムのプロットDNA含量ゲート3とゲート4で定義された集団のための。所望であれば（ 図2Eおよび2F）ヒストグラムもまた（図示せず）は、セルサイズを含めることができる。セルサイズのヒストグラムについては、集団はX軸とy軸上のカウントにFSCをプロットし、ゲート5及び6に設定されるべきである。
5. 10,000 GFPまたはRFP陽性のイベント（これはゲート4になり、ゲート1、ゲート2およびGFPまたはRFP正のゲートの派生門）で停止する録画を設定します。 6,000の範囲で- 10,000 GFP陽性のイベントは、伝統的に出版品質プロファイル^9,11の目標であった。私たちは高品質のプロファイル用の4つのイベント¹⁰十分なゲートを得るために正の約50％のGFPである15羽や目の最小値を、使用することをお勧め。しかし、我々が正常に6羽（ 図3A）と同じくらい少ないから予備細胞周期解析のための明確なデータを取得しています。 300μLの取得音量を設定し、これは全体の0.5ミリリットルのサンプルの約460μLを使用します。 タBLE 2は、 図2の例のためにテンプレートで提供、適切なしきい値と電圧設定を示しています。
6. 標準感度や高感度を100μl/分とレコードでサンプルを実行します。我々は、異なる感度レベルを持つ我々の分析では差はほとんどを見つける。細胞を集束音響のために、このサイトメーターは、正確に、非常に高い流量で試料を測定することができる。従来のメーターとは異なり、我々は毎秒1,500イベントの速度で、最大取得することによって、データの妥協点を見つけることはありません。同調ソフトウェアによって生成される記録されたデータファイルは、ほとんどの細胞周期モデリングソフトウェアと互換性がある。FCS形式である。

5。データ解析

1. GFPのセルサイズおよびDNA含有量のヒストグラム（又はRFP）正および負の集団を比較することができる。これらは手動でコピーしてAdobe Photoshopのソフトウェアを使用して貼り付けて階層化することができます。 y軸が自動に設定されている場合は、Y軸は時間をスケールする各サンプルのighestカウント。オートスケールのY軸が設定された二つのグラフを重ねると、各集団のグローバル最大値に設定された軸を持つヒストグラムのオーバーレイを作成します。これは、（ 図3Bの例）GFP陽性およびGFP陰性集団の合計細胞数が等しくない場合であっても、フェージング細胞周期の相対的変化を容易に視覚的な比較を可能にする。あるいは、カスタムy軸（y軸の手動オプション）ヒストグラムの固定値に設定することができる。この場合、2つの母集団の相対細胞数を比較することができる。 図3Fにワークスペース（この例では、実行時 ​​に自動的に生成された統計表から得られる同調は、総人口の割合と各ゲートで、ランあたりのサンプル、各実行のための細胞の絶対定量化の定義されたボリュームを使用するように）。ドットプロットとヒストグラムも簡単に、単純に目の異なるサンプルをドラッグ＆ドロップすることで、同調させるソフトウェアで積層することができます比較のために開いているサンプルの所望のグラフの上に右の電子サンプルファイルメニュー。しかし単一のサンプル（同一サンプル内の負すなわち GFP陽性およびGFP） の中から集団をオーバーレイする、我々は、Photoshopを使用しています。
2. 二つの方法は、母集団のための細胞周期の異なる段階での相対的な割合を見つけるために使用することができる。近似​​法は、G1、S、G2と> G2ピークの境界を線引きするためにユーザ定義された領域に依存している。このメソッドは、ユーザーが定義した領域内の割合（ 図3E）の迅速かつ容易に推定することができます。我々は、エチニル-デオキシウリジン（EDU）の取り込みを使用してS期ために標識ショウジョウバエ Kcの細胞との直接テストに基づいて私たちの地域を設定します。第二の方法は、細胞周期分布の推定のために第三者のモデリングソフトウェアを使用する。我々は、 図3Fに、例えばModFitLT（Verityのソフトウェアハウス）ソフトウェアを使用していました。

結果

図2に設けられたGFPテンプレートを使用して、組織の後半でGFPを発現し、幼虫の翼サンプルの代表的な結果を示す。同様の結果は、同じ組織型および未RFPテンプレート（ 図3A）を用いてRFPの発現パターンが得られる。提供されるテンプレートおよび電圧（表2）幼虫の眼（ 図3B）、脳および翼、ならびに蛹目、脳（ 図3D）と翼の分析に適して?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、細胞周期、相対的なセルサイズおよび様々な発生段階でのライブショウジョウバエ組織の相対的な細胞数の分析を可能にする。この分析は、細胞型特異的蛍光タンパク質の発現またはトレースの系統に結合されると、詳細情報が目立たない細胞周期または成長摂動に対する細胞応答について得ることができる。原理の証明として、我々は、脳細胞?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube	BD Falcon	352058	5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps	Fine Science Tools	11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15003-08	Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Life Technologies/ Invitrogen	V35003
Table 1. Required reagents and instruments.
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1 Threshold (x1000) 100 10 10 10 Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150 Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.