El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

Resumen

Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar marino Aplysia Después de la anestesia, el aislamiento de las neuronas para el cultivo a corto plazo de los tejidos, y las grabaciones de las corrientes de iones de células individuales a través de la técnica de patch clamp.

Resumen

El molusco gasterópodo marino Aplysia californica tiene una historia venerable como un modelo de funcionamiento del sistema nervioso, con especial importancia en los estudios sobre el aprendizaje y la memoria. Las preparaciones típicas para este tipo de estudios son aquellos en los que la sensorial y motoneuronas se dejan intactos en un animal disecado mínimamente, o neuronal de co-cultivo técnicamente elaborada de sensorial y motoneuronas individual. Menos común es la preparación neuronal aislado en el que pequeños grupos de neuronas nominalmente homogéneos se disocian en células individuales en cultivo a corto plazo. Tales células aisladas son útiles para la caracterización biofísica de las corrientes de iones utilizando técnicas de patch clamp, y la modulación selectiva de estos conductancias. Se describe un protocolo para la preparación de tales cultivos. El protocolo se aprovecha de los fácilmente identificables las neuronas sensoriales de los ganglios de la glutamatérgicas pleural y bucal, y describe su disociación y un mantenimiento mínimo in la cultura durante varios días sin suero.

Introducción

El molusco opistobranch marino Aplysia, ha sido un modelo neurobiológico útil para muchas décadas. Es mejor conocido como modelo de habituación y condicionamiento clásico ^{7, 8.} Los estudios sobre el aprendizaje y la memoria en este modelo ganó el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2000 por Eric R. Kandel, en un premio que compartió con Arvid Carlsson y Paul Greengard ^10. Los estudios que implican registros eléctricos a partir de preparaciones reducidas, en la que los elementos del sistema nervioso de este invertebrado se diseccionaron a partir del animal con los nervios y los músculos dejaron adjunta, han ayudado a aclarar los papeles de las neuronas individuales en Aplysia. Identificación de los mecanismos moleculares precisos que constituyen el aprendizaje en Aplysia sin embargo, a menudo empleado otra técnica, a largo plazo co-cultivos de una neurona sensorial y un motoneuronas, obtenido de uno en uno a partir de animales donantes individuales y se dejó formar una sinapsis en la placa de cultivo de ²¹ .

Nosotros y otros ^{1, 3, 6, 14, 15, 16} hemos explotado la facilidad con la que identifican las neuronas se pueden orientar en este modelo, así como su resistencia en experimentos a largo plazo para hacer cultivos a corto plazo disociados de grupos de neuronas nominalmente homogéneos en el que se estudian las corrientes iónicas bajo fijación de voltaje en la configuración de patch clamp. Muchas neuronas Aplysia se levantan a las reiteradas rondas de parche de sujeción para dar tiempo a las manipulaciones experimentales de larga duración. La técnica es útil para las neuronas como las células neurosecretoras bolsa del ganglio abdominal, y las neuronas sensoriales de los ganglios pleural y bucal cuya disociación como se describe aquí, pero no para las neuronas muy grandes> 60 m de diámetro, tales como L7 o R2 de el ganglio abdominal. No empleamos suero Aplysia en nuestras culturas, a diferencia de los senso-motoneuronas co-cultivos descritos en otro lugar. La mayoría de las neuronas obtenidas mediante este procedimiento no podrá contar con procesos para tél primero 48 h en cultivo, facilitando toda grabación de voltaje de la célula, pero entonces brotar y elaborar los axones y otros procesos durante aproximadamente 14 días antes de morir a causa de la falta de nutrientes y / o factores de crecimiento.

Esta técnica produce cultivos primarios de neuronas 50-100 por plato de regiones fisiológicamente documentados de los ganglios bucal y pleural. Este protocolo es útil para los investigadores que estudian aspectos de la fisiología de células individuales en experimentos que requieren numerosos experimental repeticiones por animal. Se produce un par coincidente de los cultivos debido a la separación anatómica de las células diana en hemiganglia izquierda y derecha, permitiendo estudios que se benefician del tratamiento combinado y los cultivos de control.

El protocolo se dirige bucales S racimo (BSC), las neuronas del ganglio vestibular, y ventrocaudal (PVC) pleurales neuronas del ganglio pleural. Estas células son de un tamaño apropiado para el conjunto de grabaciones de voltaje de la celda de visualización y Robust respuestas glutamatérgicas. La metodología discutida es apropiado para la mayoría de los ganglios en el sistema nervioso Aplysia.

Protocolo

1. Preparación de células

1. En el Día 1, pesar y anestesiar a los animales.
   1. Pesar unos 30 g, 1 kg animal. Se anestesia en animales 5-10 volúmenes de agua de mar 01:01: MgCl isotónica. 6H ₂ 0 durante 1 hora con aireación, tales como una bomba de aire de acuario eléctrico con piedra de aire adjunto.
2. Prepare suministros de disección.
   1. Montar la bandeja de disección limpia con alfileres de acero inoxidable, tales como pasadores de tela. Montar varios platos de Petri que contenían agua de mar artificial (ASW; véanse las Tablas 1 y 3) + penicilina / estreptomicina (P / S).
   2. Tenga listo un microscopio de baja potencia. Tener instrumentos de disección limpias listas, como la nariz crucería y pinzas quirúrgicas finas y finas y grandes tijeras quirúrgicas. Rocíe los instrumentos con un 70% de alcohol isopropílico antes de su uso y deje secar.
3. Posición animal en la bandeja de disección.
   1. Posición animales cara ventral hacia abajo en la bandeja de disección. Pin animalesa través de los bordes de la pared del cuerpo y las fronteras parapodiales, pero evite la cola y la cabeza, para exponer la superficie dorsal y la ranura genital
   2. Enjuague la superficie dorsal en el agua fría de la llave de ejecución lenta. Aplicar una corriente de luz de 70% de alcohol isopropílico a partir de una botella flexible a lo largo de la ranura genital y sobre la parte superior de la cabeza.
4. Hacer la incisión inicial.
   1. El uso de un microscopio de baja potencia (véase la Tabla 2) y la luz reflejada para observar el punto en el que la ranura genital origina en el margen de cáscara anterior, mantener tensada con unas pinzas de punta acanalada un pliegue de tejido a la izquierda de este origen, mientras cortando un poco profunda el hoyo todo el camino a través del área lisa, plana de la pared del cuerpo justo a la derecha de la ranura genital con tijeras en ángulo finas.
   2. Hemolinfa deberá observarse para verter en el agujero, a veces llevando consigo el ganglio abdominal y el estómago.
5. Ampliar la incisión.
   1. Use tijeras grandes para expandir ªe incisión anterior a un punto entre los rinóforos, mientras tira hacia arriba con la cuchilla inferior para evitar cortes en el intestino. Se observaron los órganos internos que se derrame fuera de la incisión.
6. Retire los ganglios.
   1. Vuelva a colocar la bandeja y reorientar el microscopio en la región de la cabeza.
   2. Con unas pinzas limpias y tijeras finas, quitar la cabeza ganglios cortando en un momento los nervios que forman la cabeza de los ganglios en un anillo alrededor del esófago para eliminar pleural-pedal y cerebral ganglios como grupo.
   3. Retire el ganglio vestibular que se adhiere a la parte ventral del esófago.
   4. Retire el ganglio abdominal cortando los 4 grandes conectivas nerviosas que emiten desde este ganglio.
7. Aislar los ganglios de interés.
   1. Recortar los ganglios de la cabeza aparte, dejando una longitud de conectores unidos a cada ganglio de interés que es igual a al menos el diámetro del ganglio; esto retardar enzima sobre-digestiónde las células de interés en el siguiente paso.
   2. Ponga cada ganglio objetivo a través de 2 enjuagues de ASW + P / S, moviéndose entre enjuagues con pinzas limpias.
   3. Si la orientación de las células de PVC, deje el hemiganglion pleural derecho accesorio a la hemiganglion pedal derecho, y del mismo modo dejar el hemiganglion pleural izquierdo conectado al hemiganglion pedal izquierdo.
   4. Desechar los ganglios no deseado y el resto del animal de acuerdo con la práctica aceptada la investigación.
8. Digerir enzimáticamente los ganglios.
   1. Para cada ganglio, preparar 1 ml de solución de enzima que consiste en 3,75 mg dispasa, 1 mg de hialuronidasa y 0,3 g de colagenasa tipo XI por ml de ASW + P / S en un tubo cónico de 15 ml de polipropileno.
   2. Lugar enjuaga ganglios en la solución enzimática y coloque la tapa. Se coloca el tubo en posición horizontal sobre un agitador rotatorio (véase el cuadro 2) a baja velocidad durante 13-5 horas durante la noche a aproximadamente 23 ° C (temperatura ambiente).
9. Prepare elplacas de cultivo.
   1. Antes de microdisección (Día 2), preparar poli-D-lisina (PDL) recubiertos con placas de cultivo en una campana de cultivo de tejido. Añadir ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml de agua estéril) para el centro de un plato de 35 mm para ~ 25 min.
   2. Enjuague PDL 3 veces con agua estéril. Deje que se seque. UV-esterilizar las placas.
10. Día 2 Aislar las neuronas.
    1. Llene el centro de 35 mm platos que eran PDL-revestido y UV esterilizada con aproximadamente 0,5 ml de la ASW + P / S para crear una isla de los medios de comunicación en el interior del plato de otro modo seco. Esto se puede hacer en el banco, fuera de la campana de cultivo de tejido. Uno de los platos debe estar preparado para cada grupo de células procedentes de una hemiganglion.
    2. Tenga listo un plato de disección de 100 mm de diámetro hecha por Sylgard-recubrimiento y curado de un mm de la superficie de la disección profunda 5, equipado con pasadores de disección finas de varios tamaños para ser utilizados como alfileres y sondas (véase la Tabla 3). Enjuague este plato con un 70% de alcohol isopropílico y después con ASW + P / S, y finalmente fill con ASW + P / S.
11. Prepare microdisección de los ganglios digerido.
    1. Verter la solución de enzima que contiene la pleural-pedal y bucal ganglios digerido en el plato de disección.
    2. Coloque el plato en la platina del microscopio sobre una superficie negro con luz reflejada.
    3. Utilizando el tejido conectivo adjunto, precisar cada pleural-pedal hemiganglion lado dorsal hacia arriba. Los tejidos deben ser suaves e intolerante de estiramiento.
12. Microdissect neuronas PVC.
    1. Uso de 2 pares de pinzas finas limpias, y que sostiene un pasador de disección fina en un par de fórceps como una sonda, aislar las células de PVC a partir de una hemiganglion pleural. La digestión enzimática se han eliminado o roto aparte la vaina de tejido conectivo que cubre el clúster de PVC, sin embargo, las células se adhieren el uno al otro.
    2. Utilice la sonda para separar estas células desde el pedal de conjuntivo-pleural ^18, a continuación, dejar que la caída grupo de células a la parte inferior de la disecciónplato.
13. Transferir las neuronas a placa de cultivo.
    1. Transferir el grupo de células a un preparado 35 mm de placa de cultivo por succión suavemente el clúster en la punta de un poco pulida al fuego desechable de pipeta Pasteur de vidrio, a continuación, dispensación lentamente en la isla los medios de comunicación en una placa de cultivo, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire en la pipeta. Repita el aislamiento del grupo PVC de la otra hemiganglion y colocar en una placa de cultivo independientes.
14. Microdissect y transferir las neuronas BSC.
    1. De clavijas de salida del lado ventral ganglio vestibular arriba, con cuidado de sobra las células de interés. Repita el paso 1.12, y los 2 grupos de células BSC del ganglio vestibular ^10.
    2. Aislamiento de las neuronas de PVC y el BSC producirá 4 placas de cultivo que contienen grupos de neuronas: 2 platos que contienen grupos BSC y 2 platos que contienen grupos de PVC. Deseche el resto de los ganglios y dejar de lado el plato de 100 mm disección.
15. DissocIATE los grupos de células.
    1. Coloque una placa de cultivo que contiene las células en la platina del microscopio de baja potencia y retire la cubierta.
    2. Disociar el clúster de PVC con un movimiento rápido suavemente la parte inferior de la placa de cultivo adyacente a la agrupación de células con un pasador de disección fina celebrada en fórceps. Sacudiendo está cavando la punta del alfiler en el plástico de la parte inferior del plato como si tratara de cavar una mota de plástico. Cuando la fricción con el plástico libera el punto de pin, una ola de percusión se produce a través del medio que se rompe la mata cerca de las células.
    3. Pueden ser necesarios 5-10 películas a casi disociar completamente las células, pero es mejor dejar pequeños grupos de células en lugar de a flick demasiado no sea que las células serán destruidas por pura mecánica.
    4. Colocar la tapa y repita con otras placas de cultivo.
16. Almacenar los cultivos celulares.
    1. Coloque las placas de cultivo que contienen islas de medios en sus centros con células disociadas enun gran contenedor que permite la circulación de aire, tal como una x 25 mm ronda placa Petri de plástico 150, y colocar este plato en una incubadora a 17 ° C.
    2. Instalar en la cámara de un recipiente abierto de agua como una fuente de humedad. Dejar reposar durante la noche. Las células se adhieren al revestimiento de poli-D-lisina en el centro del plato.
17. Placas de cultivo de inundación.
    1. El día 3, inundar suavemente los platos con 2,5 ml de ASW + P / S. Examinar y contar las células usando un microscopio invertido cultivo celular. Conservar en el 17 ° C incubadora.

2. Electrofisiología

El método es parche estándar de sujeción que se ha descrito en numerosos textos (por ejemplo, Sakmann y Neher, 1995) ^16. Este protocolo funciona en células ≤ 100 pF de capacitancia o células <60 m de diámetro durante los días 3 y 4 del protocolo. Las células sin procesos son óptimas para la grabación. La siguiente EXAMEN especialiones se aplican:

1. Las células más grandes pueden ser acomodados con la opción de configuración del amplificador 200B Axopatch establecido en β = 0,1. La activación de corrientes muy grandes puede causar que las células se escapen de fijación de voltaje. Soluciones ASW sustituido para el contenido de sal (por ejemplo, una fracción de la de NaCl sustituido con impermeable al cloruro de N-metil-D-glucamina) se puede usar para reducir la amplitud de corriente de la célula entera.
2. Fibra llenos de borosilicato pipetas parche tirados en un extractor de pipeta y rellenada hasta la mitad con una solución intracelular (ICS) que consta de 450 mM KCl y otras sales (ver Tabla 1) son adecuados, y deben tener una resistencia de aproximadamente 0,5 a 1 MOhm. Si se desea el aislamiento de las corrientes iónicas específicas, por ejemplo, corrientes de Na ⁺ en la ausencia de corrientes de K, K ⁺ en esta solución puede ser sustituido por otros iones tales como Cs ^+. Cl ^- sustitución de ICS con un anión impermeant también se justifica si se desea un ICS más natural^9.
3. Las células son robustos con> 1 hr-largas grabaciones posibles a temperatura ambiente. La grabación es óptima en los días 3 y 4 del protocolo, correspondientes a 24-48 horas de cultivo. Después de 48 horas hay dificultades para formar sellos GigaOhm, quizás a causa de elaboración de un glicocálix sobre la superficie de la célula, y los problemas causados ​​por la abrazadera espacio excrecencia proceso. Las células son útiles, sin embargo, para los estudios de clamp no parches, tales como la toxicología, que se pueden completar en <14 d.
4. ASW y otras soluciones para ser dispensado desde el dispositivo de solución por gravedad, así como la solución intracelular, deben ser filtrados a través de una jeringa montada en un filtro de 0,2 micras Acrodisk (Tabla 3) para eliminar las partículas finas que interfieren con la formación de sello GigaOhm.
5. La desensibilización se produce al utilizar agonistas tales como D-aspartato (D-Asp), por lo tanto, ~ 1-2 minutos entre las aplicaciones de los agonistas se recomienda. Por el contrario, la potenciación se observa a menudo con una rápida aplicación repetidacationes de agonistas tales como L-glutamato (L-Glu).
6. Agonista de corrientes activadas tales como L-Glu pueden ser estudiadas mediante la aplicación de agonistas con la Picospritzer pipeta. Esta pipeta se tira de la misma como la pipeta de parche y contiene agonista en ASW. Cuando la punta de la pipeta se coloca por debajo de la tubería de salida del dispositivo de solución por gravedad, y en un ángulo de 45 ° respecto a la tubería de salida (Figura 2F), agonista se lavó rápidamente fuera de la celda, y la desensibilización se reducirá al mínimo. El agonista de la pipeta debe crear un ángulo de 90 ° o más en relación con la pipeta de parche.

Resultados

La ubicación de las neuronas sensoriales en los ganglios que están dirigidos en este protocolo, las neuronas BSC y PVC se muestran en la Figura 1. Las neuronas BSC están situados en 2 grupos ovales simétricas en el lado ventral del ganglio vestibular, la superficie que se enfrenta lejos de la masa en el ganglio vestibular intacta (Figura 1A). Las neuronas de PVC forman grupos bilaterales, en forma de V que se envuelven alrededor de la superficie dorsal del ganglio pleural hacia el e...

Discusión

Las técnicas de disociación describen aquí dió cultivos de neuronas sensoriales que contienen 50-100 neuronas aisladas intercalados con pequeños números de células gliales y otras células no identificados. Los pasos más críticos en el protocolo son el tiempo de los ganglios permanecen en solución de enzima, y ​​agitando, la disociación de los grupos de células digeridas para romper el clúster en las células individuales. Digestión enzimática (paso 1.8) debe ser optimizado a la temperatura disponible...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial seawater ASW	Sigma-Aldrich	assorted	(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution	Sigma	assorted	(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100	Lonzo Walkersville, Inc.	17-603E	5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II	Roche Diagnostics	10165859001
hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272
collagenase type XI	Sigma-Aldrich	C9407
L-Glutamate (L-Glu)	Sigma-Aldrich	49601-100G
D-Aspartate (D-Asp)	Sigma-Aldrich	11200-10G
N-methyl-D-aspartate (NMDA)	Biomol	100002-268
L-Asp	Sigma	A6683-25G
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)	Sigma	A6816-5MG
L-Glu R antagonists	various	various
agar
kynurenate	Sigma-Aldrich	61250
APV	Sigma-Aldrich	A5282
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)
2-propanol	VWRSP	BDH1133
Chloriding solution	Sigma	assorted	25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer	World Precision Instruments (WPI)	SYL184	Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections	Wild
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator	Microoptics of Florida	TQ FOI-150
RotoMix 50800 orbital mixer
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives	SR Research Ltd.	Eyelink II
Tektronix digital oscilloscope	SR Research Ltd.
pClamp 10 data acquisition and analysis software	Molecular Devices
PC with Windows XP or higher operating system	PC Solutions		Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	CV203BU
Digidata 1200 A/D converter	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration	Parker Hannifin, Cleveland, OH
TMC Micro-G Vibration isolation table	Ametek
Faraday cage			custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators	Burleigh Instruments; Thorlabs		presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)	Narishige USA
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -	WPI	1B150-3
3 inch length
Ag/AgCl half cell	WPI	EP4
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes	VWRSP	21008-918
Angled Scissors	Fine Science Tools	15006-09
Dumostar Fine forceps	Fine Science Tools	11295-00
35 mm falcon tissue culture dishes	VWRSP	25382-064
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013	VWRSP	1013	also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard	WPI	SYL184
animal dissection tray	various
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon	VWRSP	21008-918	For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends	hardware store		For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points)	VWRSP		For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411	Becton-Dickinson		For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array	Narishige USA		For perfusion system
one-way valves			For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl	VWRSP		For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)
Polyethylene tubing	Cole Parmer	4.27436E+11
fine dissection pins	Fine Science Tools	26002-20
capillary tubes	Kimble 71900-100		fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay	craft store
dish holder for microscope stage with isolated ground bath			Custom manufacture
pasteur pipettes	VWRSP	14672-412
pipette bulbs	VWRSP	53283-911
acrodisk syringe filters	VWRSP	28144-040
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass	WPI	1B150F-3
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.