Ecografia transabdominale per la diagnosi di gravidanza nel cervo Muntjac di Reeves

Riepilogo

L'ecografia transabdominale è descritta come un mezzo efficace e non invasivo per valutare lo stato riproduttivo nel cervo muntjac di Reeves. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere la diagnosi precoce della gravidanza e per valutare la vitalità fetale. Le applicazioni future di questa tecnica includono la stima dell'età gestazionale e gli effetti della malattia materna sullo sviluppo fetale.

Abstract

I cervi muntjac di Reeves(Muntiacus reevesi)sono una piccola specie cervide originaria del sud-est asiatico e sono attualmente in fase di studio come potenziale modello di trasmissione e patogenesi della malattia da prioni. La trasmissione verticale è un'area di interesse tra i ricercatori che studiano le malattie infettive, compresa la malattia da prioni, e queste indagini richiedono metodi efficienti per valutare gli effetti dell'infezione materna sulle prestazioni riproduttive. L'esame ultrasonografico è uno strumento consolidato per diagnosticare la gravidanza e valutare la salute fetale in molte^{specie animali 1-7}, tra cui diverse specie di cervidi d'allevamento^8-19, tuttavia questa tecnica non è stata descritta nel cervo muntjac di Reeves. Qui descriviamo l'applicazione di ultrasuoni transabdominali per rilevare la gravidanza in muntjac fa e per valutare la crescita fetale e lo sviluppo durante il periodo gestazionale. Utilizzando questa procedura, gli animali in gravidanza sono stati identificati già 35 giorni dopo l'accoppiamento doe-buck e questo era un mezzo efficace per monitorare in sicurezza la gravidanza a intervalli regolari. Gli obiettivi futuri di questo lavoro includeranno la definizione di normali riferimenti di misurazione fetale per la stima dell'età gestazionale, la determinazione della sensibilità e della specificità della tecnica per la diagnosi della gravidanza in varie fasi della gestazione e l'identificazione di variazioni nella crescita e nello sviluppo fetale in diverse condizioni sperimentali.

Introduzione

L'esame ultrasonografico è un metodo ben descritto di diagnosi di gravidanza nei^{bovini 1,pecore 2,3,capre 4,cavalli 5,}animali da^{compagnia 6,7}e altre specie animali domestiche. Questa modalità di imaging è stata anche identificata come uno strumento prezioso per il rilevamento della gravidanza e la stima dell'età fetale in diverse specie di cervidi in^{cattività, tra cui daini 8-11,cervi rossi 12-16,}cervi sika Hokkaido¹⁷e renne^18,19. In molti casi, l'ultrasonografia ha prodotto tassi di precisione più elevati rispetto ad altri meccanismi di rilevamento della gravidanza, come il progesterone sierica o l'analisi della glicoproteina associata alla^{gravidanza 9,18}. Inoltre, la visualizzazione ultrasonografica del tratto riproduttivo può fornire ulteriori informazioni riguardanti la vitalità fetale, l'età gestazionale e l'identificazione delle anomalie dello sviluppo che altrimenti sarebbero difficili da valutare. L'utilità dell'ultrasonografia per valutare lo stato riproduttivo suggerisce che questa metodologia dovrebbe essere adattata ad altre specie in cui vengono utilizzati programmi di riproduzione attivi.

I cervi muntjac di Reeves(Muntiacus reevesi)sono una piccola specie di cervide originaria del sud-est asiatico^20. Mentre il ciclo riproduttivo di questi animali non è ben caratterizzato nei loro territori nativi, gli studi sulle popolazioni selvatiche in alcune parti dell'Inghilterra meridionale hanno migliorato la comprensione dei loro modelli^{riproduttivi 20}. A differenza della maggior parte dei cervidi, il muntjac di Reeves sembra riprodursi tutto l'anno, senza apparenti picchi di^{ceri stagionali 20-22}. Il muntjac femminile in genere dà alla luce un singolo cerbiatto dopo un periodo di gestazione di 210 giorni e entra in modo affidabile in un estro postpartum entro 24^{ore 20-22}. Ciò non concepisce durante questo periodo postpartum tornerà all'estro circa 24-25 giorni dopo²⁰. In situazioni di captive, la riproduzione è tipicamente ottenuta dall'alloggiamento fa con uno o più maschi intatti. Questo sistema produce tassi di concepimento soddisfacenti e richiede poche competenze tecniche per il personale, tuttavia date di riproduzione esatte sono difficili, se non impossibili, da determinare.

I muntjac sono comunemente usati negli studi citogenetici a causa dell'ampia gamma di numeri cromosomici diploidi e dell'alto tasso di diversificazione cariotipica tra le diverse^{specie 23}. Questi animali sono attualmente allo studio anche come modello di patogenesi e trasmissione della malattia da prione, con particolare interesse posto sullo studio della trasmissione verticale della malattia da sprecare cronica (CWD) nei cervidi. L'importanza del muntjac in una serie di diverse applicazioni di ricerca suggerisce che dovrebbero essere stabilite tecnologie riproduttive migliorate per integrare le attuali procedure investigative. In particolare, i meccanismi non invasivi per valutare il periodo gestazionale potrebbero potenzialmente chiarire le variazioni critiche nelle prestazioni riproduttive e nella crescita e sviluppo fetale in diverse condizioni sperimentali. Inoltre, lo sviluppo di riferimenti di misurazione fetale in tempo reale sarebbe potenzialmente prezioso per stimare l'età gestazionale in situazioni in cui le date di riproduzione non possono essere determinate. Studi precedenti hanno descritto meccanismi per l'uso di misurazioni fetali, come la lunghezza della groppa della corona (CRL), la profondità toracica (CD) e la lunghezza della testa (HL) per stimare lo stadio approssimativo di gestazione nella specie cervida^{11-14, 16,17}. Inoltre, alcuni di questi studi hanno anche stabilito linee guida che descrivono quando specifiche pietre miliari dello sviluppo, come la mineralizzazione scheletrica o il battito cardiaco fetale,^{possono essere identificate 8-19}. Mentre questi dati possono essere utili per aiutare a guidare l'analisi degli ultrasuoni riproduttivi nel muntjac, la maggior parte delle altre specie di cervidi studiate hanno dimensioni corporee molto più grandi e periodi gestazionali più lunghi, riducendo il valore trascizionale di questi studi per applicazioni muntjac.

Il protocollo qui delineato descrive l'ultrasonografia transabdominale del muntjac femminile ai fini della diagnosi e del monitoraggio della gravidanza. L'esecuzione riuscita di questo protocollo può facilitare il rilevamento e la valutazione precoce della crescita e dello sviluppo fetale. Questa tecnica ha preziose applicazioni nello svolgimento di studi che studiano la riproduzione, nello sviluppo utero o la trasmissione verticale di malattie infettive in un piccolo modello cervice e può anche essere utile per scopi clinici nelle operazioni di riproduzione in cattività.

Protocollo

1. Preparazione procedurale

Tutte le procedure sugli animali descritte sono state riviste e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Colorado State University, un'associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio (AAALAC), istituzione accreditata Intl..

1. Prima dell'esame, immobilizzare gli animali utilizzando adeguati protocolli di sedazione o anestesia per fornire rilassamento e consentire un posizionamento appropriato. Un gestore trattiene il cervo mentre una seconda persona somministra la sedazione all'animale.
   Nota: Gli autori hanno trovato la seguente combinazione per fornire una sedazione efficace in questa specie: butorfanonolo (0,45 mg/kg), azaperone (0,035 mg/kg) e medetomidina (0,04 mg/kg), somministrato per via intramuscolare nei muscoli glutei.
2. Una volta che la sedata ha raggiunto un piano di sedazione che consente una manipolazione conforme, posizionarla in rimescenza dorsale o laterale su una tabella d'esame o all'interno di un trogolo a V. Elevare leggermente la testa, il collo e il torace (circa 20-30°) per ridurre il rischio di rigurgito e aspirazione del contenuto di rumine e per facilitare una corretta ventilazione durante la procedura.
   Nota: Nella maggior parte delle cervidi o di altre specie di ruminanti, gli ultrasuoni addominali vengono eseguiti negli animali in piedi; tuttavia, le piccole dimensioni e le considerazioni comportamentali di questa specie richiedono una sedazione pesante per l'esame e il posizionamento sternale è quindi più difficile e può precludere un'efficace tecnica di imaging. Il posizionamento dell'animale a metà strada tra la reclinanza sternale e laterale può essere ideale per ridurre il rischio di rigurgito e ipoventilazione e dovrebbe essere considerato, se possibile. In qualsiasi posizione reclinata, è fondamentale monitorare attentamente le respirazioni degli animali e interrompere immediatamente l'esame e mettere l'animale in rimpipisurazione sternale se si nota rigurgito o ipoventilazione.
3. Se necessario, ritagliare i capelli dall'area dell'addome da esaminare al fine di ottenere un contatto adeguato tra l'impronta del trasduttore e la pelle.
   Nota: Nella gestazione precoce, le prove della gravidanza possono essere rilevate nell'addome caudale vicino alle ghiandole mammarie. Questa regione del muntjac è tipicamente senza peli, e quindi la rasatura potrebbe non essere indicata al momento. Man mano che il feto cresce e l'utero si distenta per occupare una posizione più cranale nell'addome, il ritaglio dei capelli sarà necessario prima dell'imaging. Si deve fare attenzione a evitare di causare traumi meccanici alla pelle, comprese le lacerazioni da lamette da barba o lesioni termiche da tosaerba elettriche.
4. Posizionare l'unità ad ultrasuoni in una posizione che consenta al tecnico di visualizzare facilmente il monitor durante l'esecuzione dell'esame con la mano dominante. Inserire nel sistema informazioni sull'identificazione degli animali (nome, numero di identificazione, ecc.)per etichettare automaticamente le immagini e i loop video salvati.

2. Esame ecografico riproduttivo transabdominale

1. Applicare una generosa quantità di gel di accoppiamento acustico sull'addome caudale.
2. Posizionare un trasduttore lineare curvo a 5-10 MHz sulla pelle dell'addome caudale, immediatamente cranica al pube, e spostarla lentamente in direzione cranica per valutare le strutture all'interno della cavità pelvica. Scansiona i quadranti sinistro e destro dell'addome caudale per valutare entrambe le corna dell'utero bicornuato del muntjac.
   Nota: L'ecografia addominale completa comporta la valutazione di tutti i visceri addominali, inclusi fegato, reni, milza, tratto gastrointestinale, vescica urinaria e tratto riproduttivo. Ai fini di questo protocollo, solo l'esame della gravidanza sarà discusso in dettaglio; tuttavia, la normale comparsa di altri organi addominali caudali dovrebbe essere riconosciuta in quanto è probabile che queste strutture si incontrino durante il corso dello studio. Gli organi più comunemente visti in questa posizione includono segmenti del tratto gastrointestinale, della vescica urinaria e del tratto riproduttivo. L'intestino grande e tenue è identificato dall'aspetto tipicamente stratificato della parete intestinale. Il lume può essere pronunciato o meno a seconda del tipo e della quantità di contenuto, che può includere fluido, gas, mucose o particelle di cibo. La vescica urinaria può essere difficile da identificare a meno che non sia distesa con l'urina e gli strati della parete della vescica siano significativamente meno distinti di quelli dell'intestino. Oltre all'utero, le ovaie possono anche essere trovate sugli ultrasuoni del tratto riproduttivo del muntjac femminile. Le ovaie appariranno come strutture ovoidali vicino al polo caudale dei reni e il loro aspetto potrebbe cambiare nel corso del ciclo estroso. La presenza di molteplici follicoli maturi pieni di liquidi all'interno della corteccia è suggestiva dell'estro.
   Nota: Ruotando e/o "sventolando" la testa di scansione del trasduttore, le strutture possono essere valutate in piani trasversali o sagittali.
   1. Se necessario per differenziare un utero gravid dalla vescica urinaria, svuotare manualmente la vescica applicando una leggera pressione sull'addome caudale o posizionando un catetere urinario e ripetendo la scansione.
      Nota: L'espressione manuale della vescica deve essere tentata solo quando l'animale si trova in una posizione sternale o eretta, il che facilita un orientamento più naturale dei visceri addominali e riduce il rischio di traumi ad altre strutture. L'utero può anche essere differenziato dalla vescica urinaria valutando lo spessore della parete dell'organo. Lo spessore tipico di una vescica moderatamente distesa è di circa 1,4 mm²⁴, mentre gli autori hanno scoperto che la parete più muscolosa dell'utero gravid nel muntjac generalmente misura tra 7-8 mm.
      Nota: La gravidanza precoce è difficile da diagnosticare definitivamente a causa della mancanza di strutture fetali identificabili, e infatti la prima indicazione di gravidanza può essere semplicemente una piccola tasca fluida nell'addome caudale. Se visto in questo momento, l'embrione in via di sviluppo apparirà come una struttura iperecoica, ovoiida a amorfa all'interno dell'utero (Figura 1).
3. Apportare modifiche alla profondità, alla frequenza e al guadagno, se necessario, per migliorare il contrasto e i dettagli dell'immagine.
   Nota:frequenze più alte sono associate a lunghezze d'onda più corte, che sono necessarie per migliorare la risoluzione dell'immagine. La maggior parte dei trasduttori è in grado di operare all'interno di un intervallo di frequenze (ad esempio, 6-10 MHz)²⁴. La frequenza può essere regolata utilizzando i controlli dello scanner sull'unità ad ultrasuoni e l'aumento della frequenza si tradurrà in un'immagine più chiara. L'aumento della frequenza diminuisce contemporaneamente la profondità della penetrazione delle onde sonore; pertanto, la riduzione della frequenza può essere necessaria per visualizzare strutture più profonde, ma la risoluzione può diventare^{compromessa 24}. Per questo motivo è importante selezionare la frequenza più alta possibile per raggiungere la profondità del tessuto desiderata. Le regolazioni dei controlli di guadagno altereranno l'amplificazione delle onde sonore che ritornano al trasduttore dai tessuti e influenzeranno il grado di contrasto^{nell'immagine 24}. Il guadagno dovrebbe essere impostato su un punto in cui si ottiene un contrasto ottimale tra tessuti iperecoici e ipoecoici, e queste impostazioni potrebbero dover essere regolate a seconda delle strutture che vengono immagini.

3. Ottenere misurazioni fetali

Nota: L'età gestazionale in molte specie animali domestiche può essere stimata utilizzando intervalli di riferimento stabiliti per le misurazioni fetali ottenute dall'esame ecografico. Le misure più comunemente utilizzate includono la lunghezza dritta della groppa della corona (SCRL), la profondità del torace (CD) e la lunghezza della testa (HL)¹⁷. Sebbene non siano ancora stati raccolti dati sufficienti per sviluppare linee guida affidabili sull'età gestazionale nel cervo muntjac di Reeves, possono essere raccolte misurazioni per iniziare a stabilire questi riferimenti. La frequenza cardiaca fetale (FHR) è stata mostrata in altre specie di cervidi e ruminanti per aumentare linearmente man mano che la gestazione progredisce fino a un certo punto (tipicamente intorno al giorno 60 di gestazione), quando la frequenza cardiaca inizia a^{diminuire 17}. FHR può essere usato per stimare l'età gestazionale in combinazione con altre osservazioni ecografiche, tuttavia è più comunemente usato come misura della vitalità^{fetale 17,24}. FHR è stato calcolato nel muntjac di Reeves già 35 giorni dopo l'accoppiamento osservato.

1. Per misurare SCRL, individuare l'utero sul monitor e apportare sottili regolazioni alla posizione del trasduttore fino ad ottenere una visione sagittale dell'intero feto(figure 2 e 3). Congelare l'immagine e misurare la distanza tra l'aspetto più dorsale del cranio e la base dell'osso sacro (Figure 2 e 3).
2. Per misurare il CD, ottenere una visione sagittale del feto (la stessa immagine può essere usata per misurare scrl) e misurare la distanza tra gli aspetti dorsali e ventrali del torace (Figure 2 e 3).
3. Per misurare HL, utilizzando la stessa vista sagittale del feto descritta per le misurazioni SCRL e CD, misurare la distanza dalla cresta occipitale alla base del naso(figure 2 e 3).
4. Per calcolare la frequenza cardiaca fetale, identificare il cuore all'interno della cavità toracica del feto visualizzandone le contrazioni ritmiche. Calcola la frequenza cardiaca contando il numero di contrazioni (battiti cardiaci) che si verificano entro un periodo di tempo di 1 minuto.
   Nota: Se l'unità ad ultrasuoni utilizzata ha capacità Doppler, questa funzione può essere utilizzata per aiutare ulteriormente a distinguere il cuore da altri movimenti fetali non specifici.
5. Verificare che tutte le immagini e i cicli video salvati includano tutte le informazioni identificative necessarie, inclusi il nome o il numero dell'animale, la data, le misurazioni e le etichette di struttura appropriate.

4. Conclusioni procedurali e recupero

1. Rimuovere tutto il gel di contatto ad ultrasuoni residuo dall'addome dell'animale utilizzando un panno morbido o asciugamani di carta. Pulire il gel dal trasduttore prima della conservazione.
2. Se si utilizza il protocollo di sedazione descritto al punto 1.1, somministrare atipamezolo per via sottocutanea ad una dose di 0,25 mg/kg per invertire gli effetti della medetomidina. Se si utilizza un protocollo di sedazione diverso in cui è disponibile un antagonista, somministrare questo agente all'animale secondo dosaggi pubblicati al termine della procedura per accelerare il recupero.
3. Posizionare il muntjac su una superficie morbida in recumbency sternale, con la testa leggermente elevata per ridurre il rischio di rigurgito e aspirazione del contenuto di rumine. Monitorare l'animale da vicino fino a quando non è completamente recuperato e in grado di ammbularsi intorno al recinto senza assistenza.

Risultati

Utilizzando il protocollo qui descritto, la gravidanza può essere diagnosticata e monitorata nel cervo muntjac di Reeve con tecniche minimamente invasive. Il primo momento in cui la gravidanza poteva essere rilevata dagli autori era di circa 35 giorni dopo il comportamento di accoppiamento osservato.

Nelle prime fasi della gestazione, la gravidanza è stata diagnosticata visualizzando un utero pieno di liquidi identificato come uno spazio anecoico nell'addome caudale. All'interno dell'utero, ...

Discussione

Questo protocollo descrive l'applicazione dell'ultrasonografia transabdominale per la diagnosi di gravidanza nel cervo muntjac di Reeves. Coerentemente con altri studi ecografici, le attrezzature appropriate e la competenza tecnica sono indispensabili per un esame riproduttivo riuscito della causa muntjac. Un'attenta revisione dell'anatomia di base dei mammiferi, dei principi fisici degli ultrasuoni diagnostici e del tipico aspetto ultrasonografico dei visceri addominali aii contribuirà alla riduzione delle diagnosi err...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg)	Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa	NADA 135-780
Azaperone tartrate (0.035 mg/kg)	ZooPharm
Medetomidine HCl (0.04 mg/kg)	ZooPharm
Ultrasound contact gel	Medline, Mundelein, Illinois	MDS092005
Atipamezole hydrochloride (Antisedan) (0.25 mg/kg)	Orion Corporation, Espoo, Finland	NADA 141-033
Table 2 Equipment
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments
V-trough (optional)	N/A	N/A	Animal may be supported in dorsal recumbency on a standard examination table or other surface without the use of a V-trough
Electrical clippers or razor blades for hair removal	Oster, McMinnville, Tennessee	78005-140
Ultrasound system: Ibex Pro portable ultrasound	E.I. Medical Imaging, Loveland, CO	Ibex Pro
5-10 MHz transducer: CL3.8 5-2.5 MHz 60 mm curved linear array	E.I. Medical Imaging, Loveland, CO	290420
3 ml syringes	Covidien	1.18E+09
22 G needles	Covidien	8.88E+09