Diagnostic Ultrasound Imaging di funzione mouse Diaframma

Riepilogo

Diagnostica ecografica ha dimostrato di essere efficace nella diagnosi delle diverse malattie respiratorie in soggetti umani e animali. Dimostriamo un protocollo ecografia completa utilizzata da laboratorio del Dr. Zuo per analizzare la cinetica del diaframma in particolare in modelli murini. Questa è anche una tecnica di ricerca non invasiva che può fornire informazioni quantitative sulla funzione dei muscoli respiratori mouse.

Abstract

Analisi Funzione di roditore muscoli scheletrici respiratorio, in particolare il diaframma, viene comunemente eseguita isolando strisce muscolari utilizzando procedure chirurgiche invasive. Anche se questo è un metodo efficace di valutazione in vitro dell'attività diaframma, esso comporta un intervento chirurgico non-sopravvivenza. L'applicazione di non invasiva ecografia come una procedura in vivo è utile in quanto non solo riduce il numero di animali sacrificati, ma è adatto anche per monitorare la progressione della malattia in topi vivi. Così, il nostro metodo di imaging ad ultrasuoni può probabilmente contribuire allo sviluppo di nuove terapie che alleviano lesione muscolare indotto da varie malattie respiratorie. In particolare, nella diagnosi clinica delle malattie polmonari ostruttive, ecografia ha il potenziale di essere utilizzato in combinazione con altri test standard per rilevare l'insorgenza precoce di affaticamento muscolare diaframma. Nel protocollo attuale, si descrive come valutare con precisione diaframma contractilità in un modello murino utilizzando una tecnica diagnostica ecografica.

Introduzione

Recentemente, tecniche di imaging ad ultrasuoni di diagnostica sono state applicate a modelli murini di ipertensione renovascolare e pancreas ^1,2 cancro. Tuttavia, queste tecniche non sono stati ampiamente utilizzati in roditori respiratoria saggio di funzione muscolare. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo di imaging ad ultrasuoni di diagnostica come un valido strumento per le valutazioni in vivo longitudinali di mobilità del diaframma nei topi.

Ci sono diversi vantaggi per diagnostica ecografica. Per esempio, è invasivo, sicuro, portatile, e consente misurazioni in tempo reale ad un costo relativamente basso ^3. In particolare, alcuni dispositivi ad ultrasuoni a bassa frequenza sono stati in grado di rilevare air trapping, una caratteristica clinica della malattia polmonare ostruttiva cronica (BPCO) con lieve a grave limitazione al flusso aereo ^4. Così, diagnostica ecografica può servire come un metodo di screening facilmente accessibile e riproducibile per il monitoraggio in tempo reale di disturbi respiratori.

Tecniche di imaging ad ultrasuoni di diagnostica sono spesso applicati agli animali più grandi o soggetti umani. Tuttavia, ci sono stati un numero limitato di studi di imaging ad ultrasuoni su modelli murini, che è probabilmente dovuto alle sfide di eseguire ultrasuoni su soggetti di piccole dimensioni. Il protocollo attuale delinea una nuova procedura per misurare la funzione diaframma nel topo. Inoltre, anche se ci sono stati diversi studi sui roditori sulla funzione del diaframma, la maggior parte dei risultati sono stati ottenuti isolando fasce muscolari direttamente dall'animale eutanasia ^5-7. Al contrario, utilizzando un metodo di imaging diagnostico ad ultrasuoni in vivo per analizzare l'attività diaframma diminuirebbe il numero di animali sacrificati per la sperimentazione. Inoltre, i trattamenti a lungo termine incentrati sul rafforzamento della membrana contrattilità possono essere valutati con precisione con gli ultrasuoni in modelli di roditori senza sacrificare animali.

S copi "> Nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato un metodo efficace per la visualizzazione e l'analisi dell'attività diaframma mouse usando una macchina ad ultrasuoni, che aiuta la comprensione della funzione di diaframma in vivo, evita metodi invasivi agli animali, e facilita lo sviluppo di terapeutica trattamenti per la disfunzione respiratoria.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati e completati in conformità e il rispetto degli Institutional Animal Care ed uso commissione Ohio State University (IACUC) norme e linee guida.

1. Topo Anestesia

1. Istituire un tavolo procedura pulita con un pad isotermica riscaldata avvolta in un asciugamano chirurgico. Il rilievo di riscaldamento deve essere mantenuta tra 30 ° C e 34 ° C per stabilizzare la temperatura interna dell'animale, riducendo la probabilità di stress per l'animale.
2. Posizionare il mouse in una camera di induzione di anestesia con i seguenti parametri: flusso di ossigeno impostato a 1,5 L / min e vaporizzatore isoflurano impostato a 3,5%. Sedazione completa dovrebbe avvenire entro 1-2 min. Se una camera di induzione non è disponibile, una campana di vetro può essere utilizzato con una rete metallica posizionata nella parte inferiore per evitare il contatto diretto con l'animale isoflurano.
3. Rimuovere immediatamente il mouse dalla camera di induzione voltaè completamente anestetizzato (raggiunta quando il mouse perde la funzione motoria volontaria). Applicare un naso-cono all'animale per il mantenimento dell'anestesia. Il flusso di ossigeno deve essere diminuito di circa 0,5 L / min e il vaporizzatore isoflurano dovrebbe essere impostato in un range da 1,5 a 2,5%.
   1. Applicare una piccola quantità di pomata oftalmica direttamente alle cornee per ridurre la secchezza degli occhi ^8. Inoltre, durante l'anestesia, il mouse dovrebbe mantenere l'assenza del riflesso ritiro pedale, le mucose dovrebbero rimanere di colore rosa, e la respirazione dovrebbe apparire costante.

2. Preparazione per Diagnostic Ultrasound Imaging procedura

1. Trattenere ogni tappa del mouse sulla tabella procedura riscaldata con un adesivo rimovibile, come nastro chirurgico.
2. Usando un rasoio elettrico, rimuovere i capelli sulla superficie ventrale del corpo tra il modo addome e mezza la cavità toracica. Applicare crema depilatoria per ulteriori respostare i capelli rimanenti non tagliata dal rasoio. Pulire la crema con una garza umida dopo 2-3 minuti.
3. Rimuovere i peli in eccesso utilizzando una garza imbevuta di acqua e pulire la regione rasata con il 70% di alcool o equivalente antisettico. La sonda ad ultrasuoni viene applicato a questa zona per visualizzare la funzione diaframma. Un analgesico topico può essere fornito agli animali che avvertono lievi irritazioni cutanee a causa di depilazione.

3. Diagnostic Ultrasound Imaging Protocol

1. Accendere il dispositivo ad ultrasuoni e regolare la potenza di uscita (se necessario) sull'apparecchio per percentuale avere risoluzione ottimale.
2. Impostare la macchina ad ultrasuoni a uno B (luminosità)-mode, M (moto)-mode, o entrambi prima di imaging, che consente la corretta visualizzazione della contrazione diaframma mouse.
3. Applicare una piccola quantità di gel ultrasuoni sull'addome superiore del mouse e massaggiare il gel verso la cavità toracica.
4. Posizionare l'ultrasuono trasduttore in questa zona e l'angolo verso l'alto verso il cuore. Regolare la sonda fino a raggiungere una risoluzione ottimizzata dell'immagine. Nota: per questo protocollo, una matrice di micro-convessa o lineare phased array di trasduttori è una sonda ideale da usare grazie al minimo ingombro e un'eccellente risoluzione assiale ^9; richiede la frequenza da regolare attraverso la larghezza di banda e per questi esperimenti una gamma di 6.5-12 MHz può essere utilizzata.
5. Premere il pulsante FREEZE per salvare temporaneamente le immagini diaframma e visualizzare le contrazioni selezionati.
6. Salvare la registrazione come cine loop, che permette di successive misure di escursione diaframmatica, così come il tasso di respirazione. Nota: fotogrammi di immagini possono essere salvate nella memoria del computer o su un disco rigido esterno per le analisi future ^9.
   1. Proprio misurare la profondità del movimento del diaframma dal relax alla contrazione utilizzando calibri elettronici che fanno parte del software ultrasuoni.
   2. Convertire ilfile di cine loop in un file MPEG e determinare il tasso di respirazione contando il numero di contrazioni diaframmatiche durante il periodo di registrazione. In alternativa, il numero di contrazioni al minuto (frequenza respiratoria) può essere conteggiato dall'immagine M-mode.

4. Post anestesia recupero degli animali

1. Il mouse dovrebbe recuperare completamente dall'anestesia entro 1 ora. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.

Risultati

Una tipica immagine ecografica di un diaframma mouse viene mostrato nella Figura 1A. Il diaframma topo spostamento verticale massima è stata registrata. Questa distanza è stata calcolata misurando con precisione la profondità di movimento del diaframma da relax contrazione utilizzando calibri elettronici che fanno parte del software ultrasuoni. Tabella 1 visualizza queste misurazioni della distanza di contrazioni diaframmatici da tre diversi topi. Dopo la conversione del file cine lo...

Discussione

Il protocollo sperimentale attuale sviluppa diagnostici tecniche di imaging ad ultrasuoni specifica dell'attività diaframma in un modello murino mediante un approccio non invasivo vivo. Le impostazioni di apparecchi per anestesia sono valori approssimati, che possono essere leggermente adattate per ciascun animale in quanto topi individuo può rispondere in modo diverso ad anestesia. Per evitare somministrazione anestesia improprio, è importante controllare regolarmente i segni vitali del topo co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system	Edan	DUS 3 VET	Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol
Micro-convex array transducer	Edan	C611	Or equivalent
GE Logiq i hand-carried unit (HCU)	GE Healthcare	GE Logiq i hand-carried unit (HCU)	Or equivalent
GE 12 MHz linear array probe	GE Healthcare	12L-RS	Or equivalent
Veterinary anesthetic vaporizer	Webster Veterinary	Serial #: W422021	Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone
Isothesia (Isoflurane, USP)	Butler Schein	29405 250ML PVL	Or equivalent
Enviro-pure anesthesia absorbing canister	Surgivet Smiths Medical PM, Inc.	Part #: 32373B10	Or equivalent
Ultrasound transmission gel	HM Sonic	N/A	Or equivalent
Puralube vet ointment	Puralube	NDC 17033-211-38	Or equivalent
Deltaphase isothermal pad	Braintree Scientific Inc.	39DP	Or equivalent
Hair remover	Nair	N/A	Or equivalent
Electric razor	Remington	HC-5015	Or equivalent
Surgical tape	3M Micropore	1530-1	Or equivalent
Gauze sponges	Dynarex	3262	Or equivalent