Deux méthodes de fixation des cellules humaines de l'endomètre stromales primaires de spécimens hystérectomie

Résumé

Établir des systèmes primaires de l'endomètre stromales de cellules de culture à partir d'échantillons hystérectomie est une technique biologique précieux et une étape cruciale avant de poursuivre une vaste gamme de recherche vise. Ici, nous décrivons deux méthodes utilisées pour établir les cultures stromales de tissus de l'endomètre résection chirurgicale des patients humains.

Résumé

Beaucoup d'efforts ont été consacrés à établir des systèmes de culture cellulaire in vitro. Ces systèmes sont conçus pour modéliser un grand nombre de procédés in vivo. systèmes de culture cellulaire résultant de l'endomètre échantillons humains ne font pas exception. Les applications vont de processus physiologiques cycliques normales à des pathologies de l'endomètre telles que les cancers gynécologiques, les maladies infectieuses et les carences en matière de reproduction. Ici, nous proposons deux méthodes pour établir des cellules stromales de l'endomètre primaires à partir d'échantillons d'hystérectomie endomètre résection chirurgicale. Le premier procédé est appelé «le procédé de raclage" et intègre raclage mécanique à l'aide des lames chirurgicales ou rasoir tandis que le second procédé est appelé «le procédé de la trypsine." Cette dernière méthode utilise l'activité enzymatique de la trypsine, de promouvoir la séparation des cellules et primaire excroissance cellulaire. Nous illustrons la méthodologie étape par étape à travers des images numériques et la microscopie. Nous également providexemples de e pour la validation des lignées de cellules stromales de l'endomètre par des réactions quantitatives en temps réel de la chaîne de la polymérase (qPCR) et immunofluorescence (IF).

Introduction

Le corpus de l'utérus humain est composé de trois couches, la perimetrium (ou séreuse), le myomètre et l'endomètre. Distinguer chacune de ces couches est une étape importante pour établir des lignées cellulaires de l'endomètre. Le perimetrium est la couche la plus externe de l'utérus et composée de fines cellules séreuses. Le myomètre est la couche intermédiaire épaisse de l'utérus et le composé de cellules musculaires lisses. L'endomètre est identifié en tant que couche intérieure de l'utérus et comprend des populations de cellules épithéliales et stromales.

L'endomètre est encore subdivisé en couche basalis dont la tige population cellulaire est l'hypothèse de repeupler la couche de functionalis environ tous les 28 jours ^1. La couche de functionalis de l'endomètre humain subit des modifications biochimiques et morphologiques importantes en réponse aux hormones circulant. Ces hormones sont dérivées de la glande pituitaire et les ovaires.

Laproduction coordonnée et la libération d'hormones entraîne un cycle de reproduction. Le cycle de reproduction est conçu pour préparer l'endomètre pour les événements potentiels d'implantation embryonnaire. Chez les humains, le cycle de reproduction est connu comme "le cycle menstruel" et divisé en trois phases - proliférative, sécrétoires, et menstruels. La phase proliférative implique la prolifération de l'endomètre functionalis couche tandis que la phase sécrétoire est marquée par functionalis maturation. Plus précisément, les modifications extracellulaires, les sécrétions, et la différenciation cellulaire signalent une implantation potentielle. Si l'implantation ne se produit pas avant la fin de la phase de sécrétion, la couche functionalis de l'endomètre est éliminée au cours de la phase menstruel. L'importance de la menstruation et les événements qui déclenchent l'effusion de la couche de functionalis sont encore en discussion. Chez l'homme, il a été posé que la menstruation est le résultat d'un événement à mi-sécrétoire différenciation de phase spécifique connuecomme "décidualisation spontanée» ^2. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthodologie détaillée pour les deux méthodes d'isolement de cellules stromales de l'endomètre, et utilisons une combinaison de l'immunofluorescence et des images numériques pour démontrer l'efficacité de ces approches. En outre, nous appliquons un modèle couramment utilisé dans vitro de décidualisation spontanée pour confirmer l'isolement de cellules stromales de l'endomètre.

Protocole

Spécimens hystérectomie utilisés dans ce manuscrit ont été recueillies en concordance avec un protocole d'éthique de l'Université de la CISR approuvé numérotée IRB-RSS # 14424.

1. Acquisition des échantillons de clinique Source

1. Obtenir gouvernement et des principes éthiques en établissement et de la documentation d'approbation avant de commencer.
2. Réaliser toutes les étapes des conditions stériles.
3. Préserver le tissu dérivé du patient dans les médias (RPMI ou DMEM / High glucose) dans un tube de 50 ml à 4 ° C si l'échantillon ne peut pas être traitée dans la culture immédiatement. Les échantillons peuvent être stockés dans cet état pendant un maximum de 24 heures.
4. Laver échantillon de tissu trois fois avec 1X stérile tamponnée au phosphate (PBS) et jeter la solution entre les lavages.

2. Préparation de lignées cellulaires primaires à l'aide de la méthode Grattage

1. Ajouter 4-10 ml de milieu de croissance (RPMI ou DMEM / High Glucose supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycin) de tissu et ajouter Fungizone (0,25 ug / ml de concentration finale) pendant 30 min.
2. Jeter le milieu de croissance.
3. Laver le tissu deux fois avec du PBS 1X.
4. Placer le tissu sur une plaque de culture de 6 cm de cellules de distinguer entre les couches myomètre et l'endomètre (se référer aux figures 2A à 2C pour une description plus détaillée). Séparer l'endomètre.
5. L'utilisation d'un scalpel ou une lame de rasoir, sectionner le tissu en petits morceaux en grattant sur la boîte de culture de 6 cm de cellule. Ces rayures faciliter la fixation des cellules de l'endomètre primaires émergents. Par rapport à la méthode de la trypsine, plus le tissu est nécessaire (voir la figure 2D pour une approximation).
6. Doucement, ajouter 2 ml de milieu de croissance à plat rayé (fragments de tissus seront visibles et idéalement immobilisé à partir du mouvement de grattage).
7. Transférer la plaque (s) à un incubateur de culture cellulaire désignée (37 ° C et 5% CO _2). Désigner un lieu pour les lignes de cellules primaires, loin de OTHer des boîtes de culture cellulaire. Les cultures primaires sont plus sensibles à l'infection et de contamination.
8. Examiner les cellules au microscope optique quotidien. De petites populations de cellules devraient émerger de deux ou trois jours autour des tissus tranches (voir la figure 3B).
9. Pour maintenir les cultures, laver délicatement avec du PBS 1X et ajouter un milieu de croissance frais (2 ml) tous les trois jours. Lorsque l'augmentation du taux de prolifération, des milieux de croissance supplémentaire (3-4 ml) peuvent être ajoutés à la plaque de culture de 6 cm (s).
   Remarque: Pendant le lavage et médias changements, des morceaux de tissu seront probablement aspiré. Ceci n'affectera pas la croissance de cellules adhérentes. Des morceaux de tissu doivent être aspirés par l'étape ultérieure (2,10) en tant que nouvelles colonies sont peu susceptibles d'apparaître après une semaine.
10. Lorsque la plaque de 6 cm est d'environ 75 - 80% de confluence (voir la figure 3B), passage en utilisant 0,05% de trypsine. Cellules primaires ne peuvent pas être passées indéfiniment - geler bas une plaque de cellules dès que deux ou trois plaques sont maintained. Si plusieurs passages sont nécessaires, conformément à un protocole d'immortalisation (revue dans Ref ^3).

3. Préparation de lignées cellulaires primaires à l'aide de la méthode de la trypsine

1. Placer un petit morceau de tissu endométrial (voir la figure 2D pour un rapprochement) dans 2 ml de trypsine à 0,25% additionné de kanamycine (0,03 mg / ml de concentration finale).
2. Incuber les tissus à 37 ° C sur une plateforme rotative pendant 30 minutes.
3. Vortex brièvement le tissu.
4. Centrifuger l'échantillon à 200-400 g pendant 2 min et jeter le surnageant.
5. Ajouter trypsine frais et à la kanamycine.
6. Faire incuber le tissu à 37 ° C tout en tournant pour un hr.
7. Vortex le tissu pour 5-10 sec.
8. Ajouter 2 ml de milieu de croissance (supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine) pour désactiver la trypsine.
9. Centrifuger les cellules à 200-400 g pendant 2-3 min.
10. Jeter le surnageant et ajouter 2 ml de grandire médias à le culot cellulaire.
11. Plaque sur une boîte de culture de 6 cm de cellule. Grattage de la plaque comme dans l'étape 2.5 de préparation de lignées cellulaires primaires en utilisant la méthode Grattage n'est pas nécessaire, mais améliore la fixation et l'excroissance de cultures primaires.
12. Surveillance de cellules sous un microscope optique quotidien. Les cellules sont généralement visibles au microscope optique après 24-48 heures (voir la figure 3C).
13. Pour maintenir les cultures, de surveiller les cellules et changer de support tous les 2-3 jours comme dans l'étape 2.9.
14. Pour le passage des cellules, utilisez 0,05% ou 0,25% de trypsine lorsque les cellules atteignent 75-80% de confluence (voir la figure 3C).

4. Sauvegarde tissu supplémentaire pour l'analyse (Snap congélation et la fixation au formol)

1. Laver l'échantillon deux fois avec du PBS 1X.
2. Aspirer autant de liquide que possible.
3. Snap congélation, placer l'échantillon de tissu de l'endomètre dans un tube de 1,7 centrifugeuse (voir les figures 2F et 2G). Placez le 1.7tube de centrifugeuse dans l'azote liquide pendant 10 secondes ou jusqu'à ce qu'il puisse être considéré que le tissu a gelé le bas.
   Remarque: Prenez soin de ne pas toucher directement l'azote liquide lors de la préparation des échantillons. Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C jusqu'à leur traitement ultérieur ou d'analyse.
4. Pour la fixation au formol, couper un petit morceau de tissu endométrial (voir la figure 2H), et plonger dans 10% du formol tamponné de zinc. Après 24 heures, éliminer le formol et ajouter de l'éthanol à 70% des échantillons de tissu jusqu'à ce que le traitement ultérieur.

5. Immunofluorescence (IF)

1. Cellule fixation
   1. Préparer les cellules sur une lame de culture ou de la plaque.
   2. Doucement, laver les cellules avec du PBS 1X.
   3. Ajouter pré-réfrigéré (4 ° C) et de l'acétone Methanol (mélangés dans un rapport 1:1) pendant 5 min.
   4. Air sécher la lame avant de poursuivre. Glisser peut être stocké à 4 ° C pendant 1 à 2 semaines si nécessaire.
2. Traitement SI
   1. Réhydrater les cellules avec du PBS 1X pendant 10 min. Pour la following étapes 1-6, procéder à tous les lavages et les incubations sur une plate-forme tournante.
   2. Bloc à l'aide de PBS 1X supplémenté avec 1% de sérum-albumine bovine (BSA) et 1% d'espèces sérum spécifique (2 ^ème source d'anticorps) pendant 30 min à température ambiante (RT).
   3. Incuber dans l'anticorps primaire (voir les recommandations du fabricant pour la dilution de l'anticorps). Reportez-vous aux documents d'anticorps spécifiques. Diluer l'anticorps primaire dans un tampon de blocage frais comme à l'étape 5.2.2. Cette incubation peut être réalisée pendant au moins 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
   4. Laver 3 fois avec du PBS 1X pendant 5 min chacun.
   5. Incuber dans l'anticorps secondaire (voir les recommandations du fabricant pour la dilution de l'anticorps). Diluer l'anticorps secondaire dans du tampon de blocage frais comme à l'étape 5.2.2. Pour empêcher la photo-blanchiment, il est important de procéder à des étapes ultérieures, et ce en l'absence de lumière.
   6. Laver 3 fois avec du PBS 1X pendant 5 min chacun.
   7. Thoroughly sécher les diapositives.
   8. Ajouter milieux de montage et solution de contre-coloration DAPI.
   9. Appliquer la lamelle et sceller les bords à l'aide d'étanchéité (s). Lames peuvent être stockées à 4 ° C dans l'obscurité pendant jusqu'à 2 semaines.

6. Extraction de l'ARN

1. Pellet 1 x 10 ⁷ cellules par centrifugation. Tous les matériaux et les réactifs de ce protocole doivent être RNase.
2. Lyser les cellules dans 1 ml de réactif TRIZOL, et incuber les échantillons homogénéisés pendant 10 min à température ambiante pour compléter la dissociation des complexes de nucléoprotéines.
3. Ajouter 200 ul de chloroforme pour 1 ml de TRIZOL. Secouer vigoureusement à la main pendant 15 secondes et incuber pendant 2-3 min à température ambiante.
4. Centrifuger à la vitesse maximale (15 000 xg) pendant 15 min à 4 ° C. Trois couches en résulteront.
5. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube à centrifuger frais. Ajouter 1 pi de glycogène pour augmenter le rendement de l'ARN; Toutefois, cette étape n'est nécessaire que lorsque une petitequantité d'ARN est prévu.
6. Ajouter 0,5 ml d'alcool isopropylique à la couche aqueuse, et inverser les échantillons 3 à 5 fois. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min. Pour augmenter le rendement, les échantillons peuvent être placés dans -20 ° C ou -80 ° C pendant 30 min.
7. Centrifuger à vitesse maximale pendant 10 minutes à 4 ° C.
8. À ce stade, une petite pastille d'ARN doit être visible. Jeter le surnageant.
9. Laver l'ARN avec 1 ml d'éthanol à 75%.
10. Centrifuger à vitesse maximale pendant 5 min et jeter le surnageant. Les échantillons peuvent être lavées une fois de plus à éliminer les contaminants inorganiques, mais cette étape n'est pas nécessaire.
11. En bref, sécher le culot d'ARN jusqu'à culot d'ARN est sec (prend habituellement 7-10 min).
    Remarque: Une étape supplémentaire peut être utilisé pour diminuer la matière inorganique et de diminuer le temps de séchage. Après avoir jeté le surnageant du lavage à l'éthanol, les échantillons de rotation à la vitesse maximale pendant une minute supplémentaire et aspirer le liquide résiduel. Prenez soin de ne pas aspirer à granulés.
12. Dissoudre l'ARN dans l'eau exempte de RNase, en fonction de la taille de la pastille d'ARN. Les volumes varient généralement 10-50 pi.
13. Incuber les échantillons à 55 ° C pendant 10 min, et de mesurer la concentration de l'ARN.
14. Conserver les échantillons à -20 ° C jusqu'à leur traitement ultérieur.

7. Transcription inverse

1. Amener l'ARN de l'échantillon (1-3 pg) jusqu'à un volume de 9 pi avec H ₂ O.
2. l'ARN de la chaleur à 70 ° C pendant 10 min.
3. Pour générer un mélange maître AMV, combiner les réactifs suivants: 5 ul de dNTP (concentration de travail de 50 uM), 5 ul de oligos N6 ADN (concentration de travail de 80 uM), 5 ul de tampon 5X AMV, et 1 ul de AMV . Cette solution maître de mélange est conçu par un échantillon.
4. Ajouter 16 pi de mélange maître de l'ARN chauffée. Le volume réactionnel final est de 25 ul de réaction.
5. Utiliser les conditions suivantes PCR pour la transcription inverse: (étape 1) de 42 ° C pendant 90 min, (Stage 2) 95 ° C pendant 5 min, et (étape 3) 4 ° C jusqu'à traitement ultérieur.

8. PCR en temps réel

1. Mener des réactions de PCR en utilisant les amorces, les températures de recuit, les nombres de cycles, et de réactifs figurant au tableau 1.
   Remarque: Il est idéal pour suivre les instructions du fabricant pour l'utilisation de réactifs de PCR (voir à la société et numéros de catalogue de matériaux).

9. In vitro Protocole décidualisation (Dérivé de Ref ⁴ et ⁵⁾

1. Plate cellules de l'endomètre.
2. Atteindre une confluence de 75-85%.
3. Après que les cellules deviennent confluentes, laver une fois avec du PBS 1X.
4. Rapidement, ajouter des médias sans hormones (phénol libre RPMI supplémenté avec 5% de charbon bande de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine).
5. Après 24 heures, ajouter des médias d'hormone libre supplémenté avec de l'acétate de médroxyprogestérone (MPA) à une concentration finale de 1 uM et 8 bromoadenosine-3 ', 5'-Monophosphate cyclique (AMPc) à une concentration finale de 0,5 mM.
6. Après au moins 48 heures, arrêter la réaction et sauver la plaque (s) pour un traitement ultérieur.

Résultats

Comme l'a souligné dans la section Protocole, assurez-vous de procéder à toutes les méthodes sous gouvernement, institutionnels, et des principes éthiques lors de la manipulation et la préparation de tissus humains.

Sont inclus dans ce manuscrit est une illustration du processus général de "la méthode de raclage" (figure 1A) et "le procédé de la trypsine" (Figure 1B) utilisé pour établir des cultures prim...

Discussion

D'autres groupes ont décrit et adapté méthodologie pour la préparation de cultures stromales endométriales, dont la plupart utilisent la collagénase ^{4,12,13,15-18.} Dans ce manuscrit, nous avons fourni la méthodologie et les données pour deux endomètre méthodes de culture de cellules stromales primaires simplifiées, qui sont tous deux utilisés par notre laboratoire pour des raisons économiques et de la disponibilité pratique de la trypsine et / ou une lame de rasoir.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin	Hyclone	SH3023602 or SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube	Genesee Scientific	22-272A
1 µl, 20 µl, 200 ml and 1,000 µl Pipette	Genesee Scientific	24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml Conical Tube	Hyclone	339650
50 ml Conical Tube	Hyclone	339652
6 cm Cell Culture Dish	Thermo scientific	12-556-002
8 well Chambers	Thermo Scientific	AB-4162
Acetate	Fisher scientific	C4-100
AMV RT Enzyme/Buffer	Bio Labs	M077L
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
Buffered Zinc Formalin	Thermo	59201ZF
Charcoal strip FBS	Fisher	NC9019735
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Cover slip	Fisher Brand	12-544D
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/High Glucose	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
Donkey Anti Goat -TRITC	Santa Cruz	SC-3855
Donkey Serum	Jackson’s lab	017-000-002
E Cadherin Antibody	Epitomics	1702-1
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-1
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
Fungizone Amphotericin B	Gibco	15290-018
GAPDH Probe	Life Technologies	HS99999905
Glycogen	5Prime	2301440
Goat Anti Mouse - FITC	Jackson’s Lab	115-096-003
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Medroxyprogesterone acetate (MPA)	Sigma	M1629
MeOH (Methanol)	Fisher Scientific	A4-08-1
Mounting Media (w/DAPI)	Vector Labratories	H-1500
N6 DNA Oligos	Invitrogen
Number 15 Scraper	BD	371615
Pan Cytokeratin  Mouse mAB	Cell Signaling	4545
PBS (phosphate buffered saline)	Fisher Scientific	BP-399-4
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X	Hyclone	SV30082.01
PML Anti Goat Anti body	Santa Cruz	SC-9862
Primer(s)	Eurofins
RPMI	Hyclone	SH30027FS
RPMI (Phenol free)	Gibco	11835
Sybr Green	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Thermo	AB-4138
Trizol	Life Technologies	15596018
Vimentin Antibody	Epitomics	4211-1