Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

Riepilogo

Generazioni di nuovi saggi funzionali quali interferone gamma (IFN-γ) ELISpot, che rilevano la produzione di citochine a livello di singola cellula e forniscono sia la caratterizzazione quantitativa e qualitativa delle risposte delle cellule T possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro varicella zoster virus (VZV).

Abstract

Varicella zoster (VZV) è una causa importante di morbilità e mortalità dopo trapianto di sangue del cordone ombelicale (UCBT). Per questo motivo, la profilassi antierpetico è amministrato sistematicamente ai destinatari UCBT pediatrici per evitare complicazioni associate con infezione VZV, ma non vi è un consenso prove basate forte che definisce la sua durata ottimale. Poiché cellule T mediata è responsabile del controllo di infezione VZV, valutare la ricostituzione di VZV specifiche risposte delle cellule T seguente UCBT potrebbe fornire indicazioni sul fatto profilassi possono essere mantenute o possono essere sospesi. A tal fine, un VZV specifico interferone gamma (IFN-γ) immunospot enzimatico (ELISpot) saggio è stata sviluppata per caratterizzare la produzione di IFN-γ da linfociti T in risposta alla stimolazione in vitro con vaccino vivo attenuato irradiato VZV. Questa analisi fornisce una misurazione rapida, riproducibile e sensibile di VZV specifico cell immunità adatto per monitorare la ricostituzione del VZV dell'immunità specifica in ambito clinico e di valutare la risposta immunitaria agli antigeni VZV mediata.

Introduzione

La prima volta nel 1989 UCBT è sempre più utilizzato come parte del trattamento di vari disturbi del sangue neoplastiche e non neoplastiche in bambini ^1. VZV è un alphaherpesvirus umana citopatico che provoca due malattie diverse, varicella (dopo l'infezione primaria) e dell'herpes zoster (dopo la riattivazione). Dopo l'infezione primaria, VZV persiste per tutta la vita dell'ospite riparata entro nervi sensoriali del gangli spinali. Una delle complicanze infettive più minacciosi seguenti UCBT è associato con VZV ^2-4. Nel nostro centro clinico, in assenza di VZV la profilassi, l'incidenza cumulativa di malattia VZV malattia da VZV a 3 anni postUCBT era del 46% ^2. In questi pazienti, de novo infezione con o riattivazione di VZV è spesso associato con diffusione viscerale al sistema nervoso centrale, polmoni e fegato ^5-7. Come profilassi conseguenza, aciclovir, valaciclovir e famciclovir viene comunemente somministrato a UBCT destinatari ^8,9. Tuttavia, questa strategia di trattamento non tiene conto del potenziale protettivo di VZV linfociti T specifici o la cinetica di ricostituzione del VZV specifiche risposte delle cellule T. Potenziali problemi associati con l'uso crescente di profilassi antierpetico lungo termine includono a) overtreatment paziente; b) lo sviluppo di resistenza ai farmaci antivirali ^10,11; c) violazione di VZV specifico ricostituzione immunitaria ^12,13. Poiché il rilevamento di VZV funzionali specifici linfociti T è correlata con la presenza di una protezione a lungo termine da VZV e un miglior risultato clinico ^4,14,15, monitoraggio delle cellule mediata risposte immunitarie contro VZV nel periodo post-trapianto potrebbe comportare un uso più razionale antivirale trattamento consentendo medici di distinguere i pazienti che potrebbero trarre vantaggio da VZV profilassi da coloro il cui sistema immunitario è in grado di controllare la replicazione VZV ^4,13.

Il ELISpot saggio IFN-γ è ampiamente usato per le cellule monitoraggio risposte immunitarie mediate in una varietà di sistemi sperimentali e condizioni cliniche. Macchie sono generate a seguito clivaggio di un substrato cromogenico, generando un precipitato visibile e stabile al sito di reazione. Ogni singolo spot rappresenta quindi l'impronta di una cella producenti citochine individuale. IFN-γ ELISpot non solo misura la capacità delle singole cellule ex vivo per produrre IFN-γ in risposta alla stimolazione in vitro con antigene affine, ma fornisce anche una stima della frequenza di rispondere cellule in una data popolazione cellulare ^16,17. Oltre alla sua elevata sensibilità, IFN-γ ELISpot è semplice da eseguire, rendendo possibile il suo impiego nel contesto di protocolli clinici personalizzati volti a guidare l'inizio o cessazione del trattamento antivirale. La procedura di seguito dettagliata descries un saggio ELISpot che è specificamente progettato per rilevare e misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico dopo stimolazione in vitro con antigeni derivati ​​VZV.

Protocollo

Questo protocollo di ricerca è stato approvato dal Consiglio di CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, dove è stato condotto lo studio Istituzionale valutazione etica. Il consenso informato è stato chiesto e ottenuto da tutti i partecipanti allo studio, i loro genitori o tutori legali. Tutte le procedure eseguite nei giorni 1 e 2 devono essere eseguite in condizioni sterili (cioè sotto una cappa a flusso laminare). Procedure di sicurezza standard per il trattamento del sangue umano devono essere rigorosamente rispettate.

1. Rivestimento delle piastre

1. Permeabilize il difluoruro di polivinilidene (PVDF) membrane in fondo 96 pozzetti MultiScreen IP piastre ELISpot bianco aggiungendo ad ogni pozzetto 20 pl di 35% etanolo per 1 min. Membrane dovrebbero diventare leggermente traslucido.
2. Lavare immediatamente i pozzetti 3 volte con 200 ml di 1x tampone fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7.4) utilizzando un multichannel pipetta o un dispositivo simile. Questo passaggio è fondamentale dato che i residui di etanolo possono influenzare la vitalità cellulare e legame di anticorpo di cattura. Piastre ELISpot sono fragili e devono essere maneggiati con cura: l'uso di un lavatore automatico non è raccomandato.
3. Cappotto pozzetti con 10 ml di topo purificato cattura IFN-γ anticorpo anti-umano diluito in 1x PBS ad una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire le piastre con pellicola trasparente e regolare incubare una notte a 4 ° C.

2. Blocco Plates

1. Svuotare i pozzetti, toccando asciugare e lavare i piatti 5 volte con 200 ml di 1x PBS.
2. Riempire i pozzetti con 200 ml di terreno RPMI 1640 completo e incubare le piastre per 2 ore a 37 ° C (blocco passo).
3. Lavare le piastre 5x con 200 microlitri di PBS 1x e mantenere i pozzi pieno di PBS 1x finché le cellule sono pronte per essere placcato.

3. Cella placcatura e di stimolazione

1. Preparare peripheral cellule mononucleate del sangue (PBMC) a partire da campioni di sangue venoso umano mediante centrifugazione su gradienti di Ficoll-Paque utilizzando le procedure standard. In alternativa, utilizzando metodi standard, disgelare le aliquote di PBMC congelati in azoto liquido. Dopo centrifugazione ultimi, risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 2 x 10 ⁶ cellule / ml e incubate overnight a 37 ° C sotto atmosfera di CO ₂ 5% in un incubatore a camicia d'acqua.
2. Rimuovere PBMC dall'incubatore e risospendere in un volume finale di 5 ml di RPMI completo 1640.
3. Incubare PBMC in presenza di 10 ml di endonucleasi geneticamente da Serratia marcescens per 5 min a temperatura ambiente.
4. Rimuovere un'aliquota 50 microlitri di PBMC e mescolare con 50 ml di trypan colorante blu. Contare le celle e stimare% vitalità usando un emocitometro e l'esame microscopico (metodo esclusione del colorante). Vari metodi automatizzati per il conteggio e la valutazione della vitalità cellulare can al cellularecosì essere utilizzato. PBMC deve essere> 95% praticabile. Scartare campione quando vitalità è inferiore al 95%.
5. Centrifugare PBMC a 700 xg per 5 minuti, il surnatante scarto, e risospendere le cellule in AIM-V mezzo supplementato con 2% (v / v) di siero umano inattivato (HIS) ad una concentrazione finale di 2 x 10 ⁶ cellule / ml. Mantenere a 37 ° C fino miscele di stimolazione sono aggiunti alla piastra.
6. Aggiungere ai pozzetti, una goccia alla volta, 100 microlitri della miscela stimolazione appropriata. Tre le miscele di stimolazione devono essere utilizzati come descritto di seguito:
   1. Medio uso AIM-V integrato con il 2% (v / v) di siero umano inattivato (IHS) come controllo negativo.
   2. Utilizzare anti-CD3 anticorpo monoclonale (clone OKT3) diluito in mezzo AIM-V supplementato con 2% (v / v) IHS ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml come controllo positivo).
   3. Utilizzare antigene VZV, sotto forma di una γ-irradiati (10.000 Gy; 30 min tempo di esposizione) vaccino vivo attenuato contro VZV (1.350 unità formanti placca [PFU] / ml) diluizioneTED 1:200 in AIM-V mezzo supplementato con 2% (v / v) IHS) o 1 mg di una miscela equimolare di 67 peptidi (15 residui amminoacidici) sintetizzato sulla base della sequenza del VZV immediatamente precoce (IE63) fosfoproteina . Controllare l'efficacia irradiazione monitorando l'assenza di segni visibili di effetto citopatico dopo 4 giorni in culture di PBMC.
   4. Preparare tutti i pozzetti in duplicato.
7. Aggiungere ai pozzetti, una goccia alla volta, 100 microlitri di cellule preparate nel passo 5.4 ai pozzetti appropriati. Due pozzetti devono essere lasciati senza cellule (controllo negativo). Incubare per 20 ore a 37 ° C sotto atmosfera di CO ₂ 5% in un incubatore a camicia d'acqua. Non scuotere, spostare o impilare i piatti su uno sopra l'altro durante l'incubazione.

4. Spot Sviluppo e rilevamento

1. Scartare le cellule e lavare le piastre 10x con PBS 1x integrato con 0,05% (v / v) di Tween 20 (PBST). Tween 20 aiuta staccare cellule che hanno aderito al PVDF membrane seguente notte di incubazione.
2. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di 0,5 mg / ml biotina coniugato anti-IFN-γ anticorpo monoclonale (clone 4S.B3) diluito in 1x PBS contenente 0,5% (w / v) di siero albumina bovina (BSA). Incubare le piastre per 2 ore a temperatura ambiente.
3. Lavare i pozzetti 6x con PBST e aggiungere ogni ben 100 ml di streptavidina conjugatd con fosfatasi alcalina diluito 1:1000 in 1x PBS contenente 0,5% (w / v) BSA. Coprire le piastre e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Lavare le piastre 3x con PBST e 3x con 1x PBS. Aggiungere 100 pl di un fosfato 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP) / nitro blu tetrazolio cloruro (NBT) soluzione di substrato e incubare 5 min a temperatura ambiente.
5. Lavare le piastre sotto acqua distillata. Rimuovere la sezione inferiore della piastra ELISpot e lavare entrambi i lati della membrana con acqua distillata. Far asciugare i piatti.
6. Esaminare i pozzi ed enumerare le macchie con un d stereoscopicamicroscopio issection o la scansione delle piastre utilizzando un contatore posto automatizzato. Conservare le piastre lontano dalla luce se non possono essere esaminati lo stesso giorno.
   1. Calcolare la media dei numeri di punti contati in corrispondenti pozzetti duplicati e sottrarre il numero di punti contati in pozzetti di controllo negativo (nessuna cella) dal numero di punti contati nei pozzetti.
   2. Esprimere la produzione di IFN-γ, come il numero di unità in loco di formatura (SFU) per 10 ⁶ PBMC.
   3. Si consideri che i campioni di prova sono positivi se il numero di SFU è> 50 per 10 ⁶ PBMC e 2 deviazioni standard (SD) sopra il controllo negativo (medium cellule + AIM-V integrato con il 2% (v / v) IHS).
   4. Utilizzare un valore di 400 SFU per bene quando i punti sono troppi per essere contati.
7. Verificare se i dati ELISpot sono distribuiti normalmente o non utilizzare il test di Kolmogorov-Smirnov. Quando i dati sono distribuiti normalmente, effettuare confronti statistici con t tes di Studentt (2 gruppi) o ANOVA e il post-test di Bonferroni (confronti multipli). Se i dati non sono distribuiti normalmente, utilizzare il test di Mann-Whitney U (2 gruppi) o il test di Kruskal-Wallis e post-test di Dunn (confronti multipli).

Risultati

Il protocollo ELISpot IFN-γ sopra descritto è stato sviluppato ed ottimizzato nel nostro laboratorio per misurare l'entità e la qualità delle cellule risposte immunitarie mediate dirette contro VZV ^4. Diverse fonti di antigene VZV possono essere utilizzati per la fase di stimolazione. Questi includono: a) disponibile in commercio dei detergenti estratti inattivati ​​da VZV infettate cellule Vero ^18; b) le piscine di sovrapposizione peptidi sintetici da specifiche proteine ​​codifica...

Discussione

Modifiche e risoluzione di problemi: saggi IFN-γ ELISpot sono stati utilizzati per esaminare le risposte immunitarie mediate da cellule contro una varietà di patogeni microbici, inclusi tipo virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) ^24,25, virus dell'epatite C (HCV) ^{26, 27,} e Mycobacterium tuberculosis ^28,29, solo per citarne alcuni. Qui abbiamo descritto lo sviluppo di un ELISpot test IFN-γ per misurare l'immunità cellulare contro, con la speranza di definire ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.