Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Riepilogo

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Abstract

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Introduzione

SNF2 complessi di rimodellamento della cromatina famiglia includono un centro SNF2-come ATPasi subunità ^1,2. Alcune funzioni ATPasi SNF2-come come enzimi singole subunità, mentre altri funzionano come la subunità catalitica di grandi complessi multi-subunità. Chiarire i meccanismi molecolari attraverso i quali ciascuna delle subunità dei complessi di rimodellamento della cromatina contribuiscono alla loro attività richiede la capacità di effettuare saggi biochimici che sezionano il processo di rimodellamento.

ATP-dipendente rimodellamento dei nucleosomi dal complesso INO80 umano e di altri enzimi rimodellamento della cromatina può essere immaginato come un processo multi-step che inizia con il legame dell'enzima rimodellamento di nucleosomi, seguita dall'attivazione del suo DNA e / o nucleosoma-dipendente ATPasi, traslocazione dell'enzima rimodellamento sul DNA nucleosomal, ed eventuale riposizionamento dei nucleosomi ^1,2. Comprendere i dettagli molecolari del ATP-dipendente processo di rimodellamento della cromatina requires dissezione della reazione rimodellamento nelle sue singole fasi e la definizione dei contributi delle singole subunità del complesso rimodellamento della cromatina per ogni fase della reazione. Tali analisi richiedono la capacità di analizzare il rimodellamento dei nucleosomi e altre attività utilizzando substrati molecolari definite in vitro.

In un protocollo JOVE precedente, abbiamo descritto le procedure utilizzate per generare INO80 complessi di rimodellamento della cromatina e Sottocomplessi con composizioni subunità definite ^3. Qui, vi presentiamo tre saggi biochimici che permettono l'analisi quantitativa del legame, DNA e nucleosomi attivato ATPasi, e le attività di rimodellamento nucleosoma associati a tali complessi nucleosoma.

Protocollo

1 ATP-dipendenti nucleosoma ritocca saggi

Per misurare ATP-dipendente attività nucleosoma rimodellamento, immunopurified INO80 o Sottocomplessi INO80 vengono incubati con ATP e un substrato mononucleosomal, che contiene un singolo nucleosoma posizionato ad una estremità di un frammento di DNA di 216 bp, ³² P-marcato. I prodotti di reazione vengono quindi sottoposti ad elettroforesi in gel di poli-acrilammide native.

1. Per generare il P-marcato, '601' frammento di DNA ^32, amplificare da pGEM-3Z-601 ⁴ un frammento di DNA 216 bp contenente un 601 nucleosoma sequenza di posizionamento finale in posizione, utilizzando gli oligonucleotidi 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG e 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG come avanti e retromarce primer.
   1. Impostare un 100 microlitri reazione di PCR come descritto nella Tabella 1.
   2. Eseguire le reazioni PCR in un termociclatore con il seguente programma: 1 min a 96 ° C, followed da 45 sec a 94 ° C, 30 sec a 57 ° C, 60 sec a 72 ° C per 30 cicli; termina con 7 min a 72 ° C.
   3. Dopo la reazione di PCR, rimuovere i nucleotidi non incorporati facendo passare i prodotti di reazione per due volte attraverso le colonne di spin priva di nucleasi.
   4. Eseguire 5 ml di prodotto purificato PCR in un gel di agarosio 1,2% per confermare che la reazione di PCR generato il ~ 216 bp frammento di DNA desiderato.
   5. Diluire 5 ml di prodotto di PCR purificato 20 volte, e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro UV. La resa media è ~ 40 ng / ml.
   6. Misurare la radioattività di 1 ml di prodotto purificato PCR in un contatore a scintillazione. Stimare l'efficienza di etichettatura calcolando il cpm / ng. Una reazione di marcatura di successo si prevede di cedere ~ 15.000 cpm / ng di 601 frammento di DNA.
2. Trasferimento nucleosomi cellule Hela sul marcato 601 DNA utilizzando un metodo di diluizione in serie ^5.
   1. Mescolare 2 pmol di³² P-601 frammento di DNA marcato con 6 mg di nucleosomi Hela (preparato come descritto ⁵⁾ in 50 ml di un tampone contenente 1,0 M di NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, e 1 mM DTT e incubare a 30 ° C per 30 min.
   2. Sequenziale diluire la miscela a 0,8 M, 0,6 M e 0,4 M di NaCl per diluizione con 12,5 ml, 20,8 ml, e 41,6 ml, rispettivamente, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, e 1 mM DTT, con 30 minuti di incubazione a 30 ° C dopo ogni diluizione.
   3. Diluire ulteriormente la miscela a 0,2 M e 0,1 M di NaCl per aggiunta di 125 ml e poi 250 ml dello stesso tampone contenente 0,1% di Nonidet P-40, 20% glicerolo, e 200 mg / ml BSA, con 30 min di incubazione a 30 ° C tra le ultime due diluizioni. Conservare il substrato mononucleosome a 4 ° C per un massimo di 3 mesi.
3. Eseguire reazioni nucleosoma scorrevole ATP-dipendenti in un volume totale di 10 microlitri. La reaction componenti sono elencati nella Tabella 2. Poiché la concentrazione ottimale di NaCl per INO80 attività nucleosoma rimodellamento è ~ 50 mM NaCl (risultati non pubblicati), regolare la concentrazione totale di NaCl in ogni reazione a 50 mm, tenendo conto della quantità di NaCl contenuta in preparazioni di nucleosomi ed enzimi.
   1. Prima di iniziare a creare i saggi, espressi poli-acrilammide gel nativi (18 x 16 cm). Per preparare un singolo gel contenente il 5% di acrilammide (acrilammide: bisacrilammide 37.5: 1), 0.5x TBE (Tris 45 mM borato, 1 mM EDTA), 0,01% di ammonio persolfato (APS), e il 0,001% N, N, N, N'-tetramethylethylenediamine (TEMED), mescolare gli ingredienti elencati nella tabella 3. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 2 ore a temperatura ambiente.
   2. Nel frattempo, per ogni reazione da eseguire, unire in un pre-raffreddata siliconato provetta da 1,5 ml microcentrifuga ~ 20 nM INO80 o INO80 subcomplesso (preparato come descritto ³⁾ con una quantità di tampone EB100 ( Tabella 4) sufficiente ad ottenere un volume di 4,75 ml. Immediatamente ri-congelare tutte le rimanenti frazioni-INO80 contenenti ghiaccio secco in polvere o azoto liquido.
   3. Impostare un cocktail master con il resto degli ingredienti, scaling up di un fattore 'X' (dove X = numero totale di reazioni +3). La quantità di ogni ingrediente necessario per una singola reazione di 10 microlitri è elencato nella Tabella 5; la ricetta dovrebbe essere aumentato a seconda del numero di reazioni da eseguire. Mescolare bene toccando il tubo o pipettando su e giù con un Pipetman e far girare il tubo per alcuni secondi in una microcentrifuga da banco.
   4. Dispensare 5,25 ml di cocktail master per ciascuna delle provette di reazione istituito nel punto 1.3.2. Mescolare bene pipettando su e giù. Iniziate le reazioni con il trasferimento di provette di reazione in un bagno a 30 ° C blocco di calore o acqua e incubare per 2 ore.
   5. Nel frattempo, preparare 'la rimozione mix' cocktail contenente concorrente DNAe nucleosomi, scaling up di un fattore X (X = numero totale di reazioni + 4). La quantità di ogni ingrediente necessario per preparare 1,5 microlitri rimozione di mix per una singola reazione è elencato nella Tabella 6; la ricetta dovrebbe essere aumentato a seconda del numero di test da eseguire.
   6. Terminate le reazioni con l'aggiunta di 1,5 ml di miscela rimozione. Mescolare bene, centrifugare, e incubare a 30 ° C per altri 30 min.
   7. Nel frattempo, pre-eseguire il gel di poliacrilammide nativo in una unità di elettroforesi verticale a 100 V per 30 minuti a 4 ° C, usando TBE 0.5x come tampone di corsa con un ancoretta magnetica all'interno della camera inferiore per mantenere costante la circolazione del buffer.
   8. Per caricare il campione, aggiungere 2,5 ml di loading dye contenenti 3x TBE, 30% glicerolo, 0,25% blu di bromofenolo, e lo 0,25% xilene Cyanol FF. Mescolare bene, far girare brevemente i campioni, e caricare sul gel con punte di carico.
   9. Attivare il gel a 200 V per 4,5 ore a 4 ° C con circolazione tampone.
   10. Per rilevare il segnale, trasferire il gel ad una pila di due fogli di carta da filtro. Avvolgere la carta da filtro con il gel sulla parte superiore con involucro di plastica trasparente, e poi esporlo a uno schermo di archiviazione al fosforo a 4 ° C per il tempo desiderato.
   11. Scansione lo schermo con un sistema di scanner di imaging isotopi e analizzare i dati utilizzando un software adatto.

2 Mononucleosome saggi Binding

Per saggiare l'affinità di legame di un dato complesso INO80 per mononucleosomes, effettuare uno spostamento di mobilità elettroforetica Assay (EMSA) utilizzando il substrato mononucleosomal generato nel passaggio 1.2.

1. Impostare la reazione Miscele per saggi di legame come descritto per i test di rimodellamento nucleosoma ma omettere l'ATP e il mix di rimuovere dalle reazioni; incubare a 30 ° C per 30 min.
2. Aggiungere 2,5 ml di loading dye per ciascuna miscela di reazione, e si applicano a un gel di poliacrilammide nativo contenente 3,5% di acrilammide (acrilammide: 3 bis7.5: 1), 1% glicerolo, TBE 0.5x, 0,01% APS, e il 0,001% TEMED.
3. Utilizzando TBE 0.5x come tampone di corsa, eseguire il gel a 200 V per 2,5 ore a 4 ° C con la circolazione del buffer ed esporre a una schermata di archiviazione fosforo.

3. DNA-e Nucleosome-dipendenti ATPasi saggi

Eseguire saggi ATPasi in miscele di reazione 5 microlitri contenenti 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl _2, 0.8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glicerolo, 0,1 mg / ml di BSA, 1 DTT mM, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 μCi di [α- ³² P] ATP (3.000 Ci / mmol). Per ogni complesso INO80 o la quantità di complessi INO80 da dosare istituire tre reazioni parallele, uno contenente tampone EB100 per misurare DNA o nucleosoma-indipendente ATPasi, uno contenente chiuso DNA plasmide circolare (5.000 bp, ~ 30 nM) per misurare il DNA ATPasi dipendente, e uno contenente Hela oligonucleosomes (~ 185 nM) per misurare nucleosoma-dipendente ATPasi. Impostare tutte le reazioni su ghiaccio.

1. Per ogni reazione, combinare 10-50 nM dei INO80 o INO80 Sottocomplessi immunopurified con una quantità di tampone EB100 sufficiente a fornire un volume di 2,2 ml in lubrificati provette da 1,5 ml microcentrifuga pre-refrigerati. Immediatamente ri-congelare eventuali frazioni-INO80 contenenti ghiaccio secco in polvere o azoto liquido.
2. Impostare un cocktail master. La quantità di ogni ingrediente necessario per una singola reazione è elencato nella Tabella 7. Scalare la ricetta di scaling up di un fattore 3 (x + 2) +1, dove X = il numero di preparati INO80 da dosare.
3. Per preparare contenente tampone 'sotto-cocktail' solo, DNA, o nucleosomi, dispensare 2,5 (x + 2) microlitri del cocktail maestro in tre tubi separati. Aggiungere 0,3 (x + 2) ml di entrambi EB100, il DNA plasmide circolare chiuso (1.5 mg / mL), o Hela oligonucleosomes (1.5 mg / mL) e mescolare bene.
4. Dispensare 2.8 ml di appropriata sub-cocktail per le provette di reazione-enzima contenente istituiti in vep 3.1. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare; evitare di introdurre bolle.
5. Per avviare reazioni, trasferire le provette di reazione ad un blocco di calore C a 30 °.
6. Dopo 5, 15, 30, e 60 min di incubazione, individuare 0,5 ml di ogni miscela di reazione su una cromatografia su strato sottile di cellulosa polietileneimmina (TLC) piastra (20 x 10 cm) in linea retta di almeno 1,5 cm dal bordo inferiore . Riportare immediatamente provette di reazione al blocco di calore 30 ° C in modo più punti di tempo possono essere presi da un unico tubo. Dopo di macchie, pulire le piastre TLC utilizzando un asciugacapelli.
7. Trasferire le piastre TLC ad una camera di vetro contenente abbastanza 0,375 M di fosfato di potassio (pH 3,5) per consentire la parte inferiore 0,5 cm la piastra TLC di essere immersi nella soluzione.
8. Coprire la camera, e sviluppare fino alla parte anteriore della fase liquida raggiunge la parte superiore delle piastre TLC. Immediato asciugare le piastre accuratamente con un asciugacapelli.
9. Esporre le piastre TLC secchi per uno schermo di archiviazione Phosphor a RT.Scansione lo schermo con un sistema di scanner di imaging isotopo e determinare la quantità di substrato ATP radioattivo e di prodotto ADP.
10. Per calcolare la quantità di ATP idrolizzata, moltiplicare ATP% idrolizzato dalla quantità di ATP presenti nella miscela di reazione partendo con la seguente formula: pmol ATP idrolizzata = 10 pmol ATP partendo reazione x [ADP / (ATP + ADP)]

Risultati

Le figure mostrano risultati rappresentativi di saggi biochimici utilizzati per caratterizzare attività INO80, tra cui nucleosoma scorrevole (figura 1) e vincolante (Figura 2) saggi e DNA o saggi ATPasi nucleosoma-dipendente (Figura 3).

L'esperimento mostrato in Figura 1 confronta la capacità di complessi INO80 intatti purificato attraverso FLAG-Ies2 o FLAG-INO80E e INO80 Sottocomplessi purificato attraverso sia FLAG-I...

Discussione

Per garantire che il rimodellamento dei nucleosomi e le attività ATPasi che osserviamo nei test dipendono l'attività catalitica di complessi INO80, e non sulla contaminazione di rimodellamento e / o enzimi ATPasi, abbiamo nucleosomi regolarmente test rimodellamento e l'attività ATPasica di versioni cataliticamente inattive di complessi INO80, purificata in parallelo con wild type INO80 utilizzando la stessa procedura. Una reazione di controllo negativo manca ATP dovrebbe essere eseguita quando saggiando l'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR reaction buffer	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA Polymerase	Roche Applied Science	11435094001
NucAway Nuclease-free Spin Columns	Ambion	Cat. # AM10070
ultrapure ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
bovine serum albumin	Sigma	A9418
N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED)	Thermo Scientific	17919	Fisher Scientific
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
Sonicated salmon sperm DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10% ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
[α-32P] ATP (3000 Ci/mmol)	PerkinElmer	BLU003H250UC
dCTP, [α-32P]- 6000Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
Equipment	Company
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertical electrophoresis unit	Hoefer	SE600X-15-1.5
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes	Costar	3207
Storage Phosphor Screen	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM filter paper	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant software	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe	Biodex	Model 14C