Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

Riepilogo

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Abstract

Le cellule tumorali rispondono alla matrice rigidità meccanica in modo complesso con un sistema coordinato, gerarchico meccano-chimico composto di recettori di adesione e proteine ​​di membrana trasduzione del segnale associati, l'architettura del citoscheletro, e motori molecolari ^{1, 2.} Mechanosensitivity delle cellule tumorali in vitro sono differenti indagato principalmente linee cellulari immortali o murine derivate cellule primarie, non con cellule primarie tumorali umane. Quindi, poco si sa circa la mechanosensitivity di pile tumorali di colon umano in vitro. Qui, un protocollo ottimizzato è sviluppato che descrive l'isolamento di cellule del colon umane primarie da campioni di tessuti umani sani e tumorali chirurgici. Isolate cellule del colon sono poi successo coltivate su substrati funzionalizzati da una matrice extracellulare morbido (2 kPa rigidità) e rigida (10 kPa rigidità) idrogel di poliacrilamide e polistirolo rigido (~ 3.6 GPa rigidità) (fibronectinain questo caso). Microsfere fluorescenti sono incorporati in morbido gel vicino alla superficie di coltura cellulare, e il dosaggio di trazione viene eseguita per valutare le sollecitazioni contrattili cellulari che utilizzano il software gratuito di accesso aperto. Inoltre, immunofluorescenza su diversi substrati rigidezza fornisce informazioni utili sul morfologia cellulare primaria, organizzazione citoscheletro e vinculina contenente adesioni focali in funzione del substrato rigidità.

Introduzione

Negli ultimi anni è diventato sempre più evidente che meccanico micro-ambiente, oltre a fattori bio-chimici, svolge un ruolo importante nella regolazione funzionalità cellulari. Le cellule possono rilevare e rispondere alla rigidità del substrato su cui sono rispettate (come in coltura 2D) o circondati da (come nella cultura 3D) ^3-7. In questo modo, le cellule possono modulare la loro differenziazione ^3, morfologia ^4, migrazione / motilità ^5, bio-fisiche ^6, di crescita del ^7, e altri processi.

Le cellule tumorali rispondono anche alla rigidezza della matrice 2D e 3D con una coordinata, gerarchico combinazione meccano-chimica di recettori di adesione e proteine ​​di membrana trasduzione del segnale associate, l'architettura del citoscheletro, e motori molecolari ^{1, 2.} Ad esempio, le cellule epiteliali mammarie (MECs) formare normale parenchima acinose quando coltivate su substrati 150 Pa che è simile alla rigidezzadi tessuto mammario sano. È interessante notare che essi mostrano i tratti distintivi di un tumore in via di sviluppo, sia strutturali che di trascrizione, quando coltivate su supporti rigidi (> 5.000 Pa) che imitano la rigidità di uno stroma tumorale ^8. Inoltre, un altro esperimento dimostra che tumorigenesi seno è accompagnata da collagene reticolazione e ECM irrigidimento ^9. Recenti esperimenti mostrano che di carcinoma del colon umano (HCT-8), le cellule mostrano metastasi come fenotipo (MLP) quando sono coltivate su substrati 2D che hanno rigidità fisiologicamente rilevanti (20-47 kPa), ma non molto rigida (3,6 GPa) substrati ^{10- 12} .Queste cellule prima forma gruppi di cellule tumorali-simili e poi dissociano l'una dall'altra, partendo dalla periferia. Dato che questo epiteliale a arrotondata morfologica (E transizione R) cambiamento si verifica, proliferano, ridurre cellula-cellula e cellula-ECM adesione, e diventare migratori. HCT-8 celle coltivate su substrati di polistirolo molto duri non presentano questetratti maligni. Così è stato ipotizzato che HCT-8 cellule diventano metastatiche a causa della loro esposizione ai appropriato microambiente. Vale la pena notare che questi esperimenti sono condotti con linee cellulari tumorali murine immortalizzate o derivati ​​pile, non con cellule primarie tumorali umane.

Uno studio recente propone aumentata sforzo di trazione cellulare può essere utilizzato come potenziale firma biofisico per cellule metastatiche ¹³ studio .Il comporta la misurazione della forza di trazione per diverse linee cellulari tumorali umane su gel di poliacrilammide. Si è trovato che le cellule tumorali metastatiche possono esercitare significativamente maggiore sforzo di trazione rispetto alle cellule non-metastatiche in tutti i casi ^13. Tuttavia, questi risultati contraddicono direttamente i risultati precedentemente pubblicate su murine derivate linee cellulari di cancro al seno ^14. Inoltre, un recente studio mette in luce notevoli differenze tra le cellule umane immortalizzate e primarie nel loro rimodellamento pro citoscheletroprofiling TEIN e la sopravvivenza delle cellule proteina espressione ^15. Quindi, è importante rivisitare molti dei saggi biofisici compreso trazione per cellule primarie tumorali umane. Questo affronterà la questione se le cellule primarie ricapitolano immortalato linee cellulari tumorali tendenza trazione.

Il protocollo qui descritto è ottimizzato per l'isolamento di cellule primarie umane colon (sani e cancerosi), e per loro coltura su substrati molli (idrogeli poliacrilammide) nonché su piastre di Petri. Il protocollo si basa sulla digestione e la conseguente dissociazione enzimatica di campione di tessuto chirurgico in sospensione singola cella ^16. A nostra conoscenza, questa è la prima dimostrazione di coltura isolato tumore primitivo del colon e cellule normali direttamente su substrati idrogel morbide con microsfere fluorescenti incorporati per trazione citometria. Substrati gel trasparenti consentono anche immunocolorazione. Questo test ha rivelato differenze nell'organizzazione F-actina eadesioni focali in cellule del colon umani primari come cambiamenti substrato rigidità. Questa piattaforma coltura cellulare apre la possibilità di esplorare le varie proprietà biofisiche di cellule umane primarie come la rigidità delle cellule e la trazione come parametri per pronostici cancro.

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito segue le linee guida del UIUC comitato etico della ricerca umana.

1. Raccolta e digestione di Campione di tessuto chirurgico

1. Raccogliere il campione di tessuto tumorale dopo la resezione del colon (Figura 1A e 1B). Raccogliere il tessuto da un sito sano adiacente pure.
2. Trasferire immediatamente il tessuto ad un flaconcino da 15 ml contenente 12 ml di soluzione HBSS. Conservare il flaconcino sul ghiaccio all'interno di una scatola di schiuma isolante.
3. Trasportare la fiala contenente il tessuto di una cappa coltura di tessuti per l'ulteriore elaborazione in 45 min. Conservare il flaconcino su un blocco di ghiaccio all'interno della cappa.
4. Versare il tessuto fornito in un 6 pozzetti contenenti 6-7 ml di soluzione HBSS con una pipetta.
   Nota: quantità di tessuto per pozzetto non è critico in questa fase di risciacquo.
5. Mantenere la piastra 6 bene su un blocco di ghiaccio. Lavare il tessuto in soluzione HBSS due volte.
6. Tagliare il tessuto in modo pulito in sezioni separate con SIC sterilisor. Tessuto Mince in sezioni più piccole non superiore a 1-2 mm ³ dimensioni, con una lama di bisturi sterile.
7. Pesare una etichetta 0,1% tripsina flacone (contenente 1 ml di 0,1% soluzione di tripsina) prima di trasferire il tessuto. Trasferire ~ 20 mg di tessuto in ciascuna delle fiale tripsina 0,1% con una pipetta.
8. Cercare di ridurre al minimo il trasferimento di HBSS nel flaconcino tripsina per evitare ulteriore diluizione della tripsina.
9. Pesare le fiale tripsina dopo il trasferimento dei tessuti; documentare la differenza come la massa di tessuto.
10. Versare ~ 20 mg di tessuto e 1 ml di tripsina in ciascun pozzetto di una piastra ben 24.
11. Mettere la piastra ben 24 su shaker in frigorifero a 4 ° C per 16-20 ore. Durante questo periodo di attesa o in un momento precedente, preparare i substrati gel di poliacrilamide e funzionalizzare con proteine ​​ECM come descritto nel paragrafo 3.

2. enzimatica dissociazione di Campione di tessuto in sospensione singola cella e coltura isolati Celle ECM funzionalizzato elastico Substrates e piatti polistirolo rigido

1. Dopo 16-20 ore di incubazione in tripsina ben a 4 ° C su agitatore, trasferire il tessuto da 4 ° C tripsina a 4 ° C completa flacone mezzi di crescita (contenente 2-3 ml di terreni di crescita completo) usando una pipetta. Garantire minimo trasferimento di tripsina in terreni di crescita.
   Nota: Complete formulazione mezzi di crescita è la seguente: RPMI 1640 medium di base integrato con siero di cavallo ad una concentrazione finale del 10% e la penicillina-streptomicina al 1% di soluzione totale.
2. Posizionare il tessuto contenente mezzi provetta in un bagno di acqua calda a 37 ° C per 12-15 min.
3. Trasferire il tessuto di una fiala da 15 ml contenente soluzione HBSS con una pipetta, agitare delicatamente.
4. Ripetere 2.3.
5. Rimuovere il tessuto dalla soluzione HBSS e trasferimento al 0,1% soluzione di collagenasi (in HBSS) flaconcino contenente 1 ml di soluzione. Incubare per 45 minuti a 37 ° C e 5% CO ₂ ambiente in una coltura cellulare incubatore umidificato. Durante il periodo di attesa, growt caldoh media in un flaconcino da 15 ml a 37 ° C a bagnomaria.
6. Estrarre tutti i frammenti di tessuto in pipetta minimizzazione collagenasi riporto. Espellere solo i frammenti di tessuto in flaconi di coltura pre-riscaldato.
7. Mettere un filtro ben inserto 40 micron in ciascun pozzetto di una piastra ben 6. Inumidire il filtro con 1 ml di coltura cellulare multimediale.
8. Tessuto triturare in media con una pipetta di vetro da 10 ml più volte fino a quando il tessuto è completamente dissociato.
9. Mantenere la punta della pipetta il più vicino possibile alla base della fiala.
10. Depositare la soluzione sul filtro per rimuovere i detriti e parti indissociate.
11. Centrifugare filtrato sospensione cellulare in mezzi a 150 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
12. Rimuovere il surnatante dopo e risospendere pellet cellulare con 2 ml di terreni di coltura fresco.
13. Contare le cellule utilizzando un emocitometro (se richiesto). Seed isolato cellule primarie di matrice extracellulare (ECM) gel funzionalizzati e piatti di polistirene al concentrazione desiderata.

3. Preparazione e funzionalizzazione di diversi Rigidità Poliacrilammide (PA) Gel e polistirolo substrati

Nota: Per la dimostrazione visiva del punto 3, gli spettatori / lettori sono riferite ad una recente ufficiale di esperimenti visualizzati (JoVE) articolo ^17.

1. L'adozione di protocolli pubblicati ^{18, 19,} attivano 12 millimetri ² copertura di vetro scivola chimicamente per garantire vincolante dell'idrogel covalente.
   1. In primo luogo, la copertura di vetro scivola trattare con 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) per 7 minuti a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere la ATS completamente con acqua deionizzata risciacquo e trattare copertura scivola con lo 0,5% glutaraldeide (diluito in PBS dal 70% soluzione glutaraldeide magazzino) soluzione per 30 minuti.
2. Ottenere 2 soluzioni gel kPa miscelando 5% w / v di acrilammide e 0,05% N, soluzione N '-methylenebisacrylamide (bis) in soluzione salina 10 mM HEPES-buffered ^20. Utilizzare 8% w / v di acrilamide e 0,13% N, soluzione N '-methylenebisacrylamide (bis) in 10 mM HEPES soluzione salina tamponata per 10 kPa gel ^20.
   1. In entrambi i casi, usare 1: 200 persolfato di ammonio (10% w / v) e 1: 2.000 N, N, N ', N' -tetramethylethylenediamine (TEMED) come iniziatore e catalizzatore per il processo di polimerizzazione, rispettivamente.
   2. Inoltre, aggiungere 100 microlitri perline fluorescenti a 2 kPa soluzione di gel come marcatori fiduciari ^{21, 22.}
3. Depositare una goccia di 20 ml di pre-polimero soluzione di gel PA il 12 mm ² attivato antiscivolo copertura in vetro. Posizionare un altro 12 millimetri ² regolare polizza di copertura in vetro sulla goccia. Assicurarsi che il calo si diffonde tra i coprioggetto per capillarità. Capovolgere il panino per 2 gel kPa per garantire che la maggior parte delle perle provengono vicino alla superficie di coltura cellulare.
4. Curare il gel PA per 45 minuti a RT.
5. Staccare la polizza di copertura superiore utilizzando un unico rasoio bordo.
   Nota: Durante peeling, il distacco procede da un bordodel sandwich. Il gel rimane aderente al vetrino attivato.
6. Conservare i gel in soluzione PBS prima dell'uso.
7. Funzionalizzare gel PA e vetro con le molecole ECM, fibronectina umana ad una concentrazione di 50 mg / ml metodi seguito pubblicati ^23.
   1. In breve, incubare substrati con 2 ml puro idrato di idrazina O / N.
   2. Rimuovere idrato di idrazina e lavare accuratamente i substrati con acqua deionizzata.
   3. Lavare le substrati con 5% di acido acetico per 30 min.
   4. Rimuovere acido acetico e lavare accuratamente i substrati con acqua deionizzata.
   5. Mantenere i substrati immersi in acqua deionizzata per 30 min.
   6. Incubare i substrati con fibronectina ossidato per 35 minuti ad una concentrazione di 50 ug / ml.
   7. Sciacquare i substrati con PBS in agitatore a basso numero di giri per 10 minuti.
   8. Incubare tutti i substrati a 37 ° C in 2-3 ml di coltura per 30 minuti prima della placcatura le cellule.
      Nota: le cellule piastra in un popolano scarsamented maniera (1.000-3.000 cellule / cm ^2). Ogni bicchiere slittamento gel-rivestito deve essere contenuta in una capsula Petri da 35 mm. Consentono alle cellule di aderire completamente prima di qualsiasi microscopia (almeno O / N).

4. trazione Forza microscopia e immunofluorescenza Microscopia saggi

1. Trazione Force Microscopy Assay
   1. Tripsina-EDTA soluzione calda 0,25% / 10% SDS a 37 ° C a bagnomaria per 10 minuti prima di iniziare esperimenti di trazione.
   2. Rimuovere un gel dalla incubatore coltura cellulare alla volta e immettere sul palco microscopio a fluorescenza invertito (32X di ingrandimento).
   3. Trovare una singola cella nel campo visivo. Togliere il coperchio piastra di Petri.
   4. Dai contrasto di fase immagine di cellule (ad esempio, figura 3).
   5. Attivare la modalità di imaging per fluorescenza e selezionare filtro appropriato. Non spostare il tavolino del microscopio o del campione durante questo periodo.
   6. Prendete l'immagine della perline fluorescenti CILINDRATAcato da trazione cellulare (Figura 4C).
   7. Aggiungere 1 ml di soluzione tripsina / SDS per capsula di Petri staccare la cella dal gel. Non spostare il tavolino del microscopio o del campione durante questo periodo. Inoltre, prendere un'immagine di controllo della cella per assicurare la rimozione completa dal gel.
   8. Prendere una immagine di riferimento (forza null) delle perline dopo che la cella è rimossa.
   9. Ripetere i passaggi 4.1.2-4.1.8 per tutti gli altri gel.
   10. Fare una serie di immagini utilizzando ImageJ dalle due immagini acquisite nella fase 4.1.6 e 4.1.8 per ciascun caso. Per generare la pila di immagini, utilizzare seguente sequenza di comandi in ImageJ dopo l'apertura delle immagini: Immagine → Stack → Immagini per impilare.
   11. Per ottenere il campo di spostamenti e la trazione, utilizzare i plugin ImageJ seguente metodi pubblicati ^{21, 22} Ottenere i codici e tutorial dettagliati per questi plugin utilizzando il seguente link:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
       1. Allineare le immagini in stack utilizzando il plugin 'template matching'. L'uso seguente sequenza di comandi in ImageJ dopo l'apertura della serie di immagini generate al punto 4.1.10: Plugin → Modello di corrispondenza → Allinea Fette di Pila → OK. Salvare l'serie di immagini di conseguenza. Usa questa nuova serie di immagini nei seguenti passi.
       2. Ottenere il campo di spostamento con il PIV (particle image velocimetry) plug (Figura 4D). L'uso seguente sequenza di comandi dopo l'apertura della serie di immagini salvata in fase 4.1.11.1: Plugin → PIV → iterativo PIV (Basic) → OK → Accetta questo PIV e uscita → Ok. Salvare l'uscita PIV nella stessa directory nella serie di immagini originale. Utilizzare questo come input nel passaggio successivo.
       3. Infine utilizzare il FTTC (trasformata di Fourier trazione citometria) plugin per avere la mappa di trazione (figura 4E). L'uso seguente sequenza di comandi: Plugin → FTTC → Insproprietà dei materiali ERT, vale a dire, il modulo di Young e il rapporto di Poisson di PA gel → OK → Selezionare il file di output PIV salvato nel passaggio 4.1.11.2 → OK. Salva FTTC risulta nella stessa directory nella serie di immagini e di uscita PIV.
2. Immunofluorescenza Microscopia Assays
   1. Prendere substrati da immunostained alla cappa laminare e rimuovere il mezzo di coltura.
   2. Risciacquare i substrati con PBS e fissare le cellule con 4% paraformaldeide in PBS per 20 minuti a RT.
   3. Lavare le substrati con PBS per 3 volte (5 min ogni volta). Di conseguenza, incubare i substrati con segnale 500 microlitri enhancer per 30 minuti e risciacquare con PBS.
   4. Incubare le cellule con anticorpi anti-vinculin monoclonale ad una diluizione 1: 250 in PBS per 45 minuti a RT. Lavare le substrati con PBS per 3 volte (5 min ogni volta).
   5. Incubare i campioni con anticorpo secondario Alexa Fluor IgG anti-topo 488 capra una diluizione 1: 200in PBS a temperatura ambiente per 30 min. Lavare le substrati con PBS per 3 volte (5 min ogni volta).
   6. Per visualizzare la struttura F-actina, incubare le cellule con TRITC falloidina coniugati ad una concentrazione di 50 ug / ml per 45 minuti a RT. Lavare le substrati con PBS per 3 volte (5 min ogni volta).
   7. Immagine i campioni utilizzando microscopio confocale a scansione laser (Figura 5A - 5D).

Risultati

Il protocollo di cui sopra è impiegata con successo per i campioni di tessuto multipli (n = 12) provenienti da quattro diversi pazienti secondo le linee guida del comitato istituzionale di revisione. La figura 1A illustra un tumore del colon-retto rappresentante destra dopo l'intervento chirurgico, da cui si ottengono le sezioni di tessuto per colture cellulari. Una tipica sezione di tessuto in soluzione HBSS dopo il trasferimento alla cappa laminare per l'ulteriore elaborazione è mostrato in ...

Discussione

Lo stress di trazione Cellular è recentemente emerso come un potenziale indicatore biofisico di stato metastatico ^13. Tuttavia, i dati non trazione sperimentale con cellule del tumore primario esiste in letteratura fino ad oggi. Inoltre, la coltura direttamente isolate cellule del colon primario su gel differenti rigidità poliacrilammide non è ancora segnalato. Quindi, noi stabiliamo un ottimizzato colon primario condizioni di coltura cellulare su gel e polistirene (Figura 2). Incapsulamen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
HBSS	Life technologies	14175-095
PBS	Lonza	17-516F
Trypsin	Worthington	LS003736
Collagenese	Worthington	LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)	Sigma-Aldrich	281778
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	01201-5
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
N- methylenebisacrylamide (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
Ammonium persulfate	Bio-Rad	161-0700
Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	161-0801
Human fibronectin	BD biosciences	354008
Hydrazine hydrate	Sigma-Aldrich	18412	Hazardous
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT15710
Signal enhancer	Life technologies	I36933
Monoclonal anti vinculin antibody	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life technologies	A11001
TRITC phalloidin conjugates	Sigma-Aldrich	P1951
0.1 µm fluroscent beads	Life technologies	F8801
0.25% Trypsin-EDTA	Life technologies	25200-056
			Materials
12 mm2 glass cover slips	Corning	2865-12