Análisis de la autofagia en<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

Resumen

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Resumen

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introducción

Los hongos filamentosos son excelentes sistemas modelo para el estudio de los procesos de desarrollo. Ofrecen varias ventajas experimentales como el cultivo barato, un alto número de progenie y accesibilidad genética. El último punto es de particular relevancia para la construcción de los transformantes que permiten investigar la importancia de los genes tan lejos no caracterizados por diversos mecanismos celulares. Los hongos filamentosos han sido instrumentales para el esclarecimiento de varios elementos y mecanismos de control de calidad de las vías celulares como actividad de la proteasa de la degradación de proteínas aberrantes, dinámica mitocondrial para mantener la integridad mitocondrial y la autofagia para la eliminación de los excedentes y / o componentes de células disfuncionales y para mantener la viabilidad celular en tiempos de ^1,2,3 inanición.

Hay varias técnicas experimentales disponibles para el estudio de la autofagia en hongos filamentosos ^2: (i) la investigación de vacuolas if que contienen cuerpos densos autofágicos cuando proteasas son inhibidas por microscopía electrónica de transmisión ^4, (ii) la visualización de autofagosomas de seguimiento de focos-GFP Atg8 a través de microscopía de fluorescencia ^{de 5,6} y (iii) la detección de estructuras autophagosomal acidificados mediante el uso de la monodansyl cadaverina colorante fluorescente ^7.

Aquí, se presenta un nuevo método de cultivo de Penicillium chrysogenum para los estudios de la autofagia. El elemento principal es el "cojín de hambre", que consiste simplemente en agarosa al 1% disuelto en el agua del grifo esterilizada. Los compuestos adicionales (por ejemplo, factores de estrés, carroñeros, moduladores de la autofagia) se pueden añadir a la almohadilla, siempre y cuando no se muestran auto-fluorescencia. La almohadilla se encuentra en portaobjetos de microscopio que contienen una cavidad central de poca profundidad. Esta almohadilla en inoculadas con una suspensión de esporas o con pequeños fragmentos de micelio. Este último es aconsejable si la cepa de interés no sporulate eficiente (por ejemplo, cepas ATG1 Δ ^8). Los portaobjetos se colocan en cámaras húmedas (estos pueden ser fácilmente construidos mediante el uso de cajas de puntas de pipeta vacías) para evitar la desecación de la muestra y se incubaron a temperatura ambiente. P. chrysogenum es capaz de crecer durante unos días en estas condiciones. La autofagia puede observar microscópicamente por la ampliación vacuolar que es un marcador positivo para la autofagia hongos. En esta contribución, una P. chrysogenum cepa (Wisconsin 54-1255) se utiliza que forma la proteína verde fluorescente que se dirige a los peroxisomas por su secuencia C-terminal 'SKL' ^9. Por lo tanto, es posible monitorizar la degradación de los peroxisomas. Es factible etiqueta también otros compartimentos de la célula (por ejemplo, mitocondrias) mediante el uso de señales de localización apropiadas y analizar su degradación. Aunque los datos de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) se presenta aquí, sin duda es posibleutilizar el método de 'almohadilla de hambre "también para otros hongos filamentosos (por ejemplo, Neurospora crassa, macrospora Sordaria, especies de Aspergillus, etc.).

Protocolo

1. Preparación de P. chrysogenum para los experimentos de hambre

1. Si el P. chrysogenum cepa de interés se mantiene en el arroz ('arroz verde'), coloque 2-3 granos de arroz cubiertas con esporulación micelio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Rellenar con 500 l YGG (10 g / l KCl, 20 g / l de glucosa, 10 g / l de base nitrogenada de levadura, 5 g / l K ₂ HPO _4, 20 g / l de extracto de levadura).
   1. Vortex el tubo durante 30 segundos de modo que las esporas pueden desprenderse del arroz de manera eficiente.
   2. Incubar el tubo durante 1 día a temperatura ambiente (por ejemplo, entre 20 y 25 ° C).
   3. Preparar una dilución 1/50 de esta suspensión de esporas en el agua del grifo estéril, mezclar bien.
2. Si el P. chrysogenum cepa de interés se mantiene en una placa de agar (por ejemplo, la placa de agar YGG), transferir pequeños trozos de micelio en un tubo de 1.5 ml contiene 400 l de agua corriente estéril y aproximadamente 100 mg glperlas culo utilizando un palillo estéril o punta de la pipeta.
   1. Vortex el tubo durante 2 min para que el micelio se fragmenta. Utilice el contenido del tubo inmediatamente.

2. Pasos preparatorios para el cultivo de P. chrysogenum en Pads de hambre

1. Encienda una placa calefactora y ponerlo a aproximadamente 60 ° C.
2. Disolver 2 g de agarosa en 100 ml de agua del grifo por la cocción de la solución en un horno de microondas. Tenga cuidado de que esta solución es del todo claro después del calentamiento. Si no lo es, cocinar de nuevo hasta que la agarosa se disuelve completamente. Deje que la solución de agarosa se enfríe a aproximadamente 60 ° C antes de su uso.
3. Llenar 1,5 ml tubos de microcentrífuga (2-4, dependiendo del número de muestras) con 400 l de agua corriente estéril cada uno (no hay compuestos adicionales añadidos) o 400-x l (adición de x l de solución de compuesto en el paso 2.5) y colocarlos sobre la placa de calentamiento durante al menos 1 min de manera que el water el interior se calienta.
4. Colocar los portaobjetos de microscopio que contienen una cavidad central en la placa de calentamiento durante al menos 1 min.
5. Añadir 400 l 2% de agarosa a la solución en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y vortex brevemente. Después de este paso, si se desea, añadir compuestos adicionales (es decir, de rapamicina 1 mM). Si esto se hace, vórtice brevemente después de cada sustancia adicional se pipetea al tubo. Ponga los tubos de nuevo sobre la mesa la calefacción para evitar la solidificación prematura.
   NOTA: El volumen total en el tubo de microcentrífuga debe ser de 800 l.

3. Preparación de preparaciones microscópicas contiene electrodos de inanición

1. Pipeta 140 l de la solución de agarosa en la cavidad del portaobjetos de microscopio (que aún se encuentran en la placa de calentamiento). Trate de evitar hacer burbujas si es posible.
2. Inmediatamente coloque una hoja de cubierta en la solución de agarosa.
   NOTA: Esto resultará en una superficie plana.
3. Ponga el microdiapositiva alcance sobre la mesa de laboratorio durante unos 4 minutos para permitir que la almohadilla de agarosa se solidifique.
4. Retire con cuidado el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa deslizándolo con la ayuda de un pulgar o el dedo índice (usar guantes para evitar la contaminación!).
5. Colocar el portaobjetos con la almohadilla en una cámara húmeda para evitar la desecación. Recomendación: Utilice una caja de propina vacío que todavía tiene el inserto para la celebración de las puntas de pipeta. Añadir agua estéril a la caja de modo que el fondo está cubierto. Colocar los portaobjetos de microscopio en el inserto y cerrar el cuadro.

4. Inocular los Pads de hambre con P. chrysogenum e Incubación

1. Pipeta 5 l de la dilución 1/50 de esporas (si los cultivos se hicieron crecer en el arroz) o 5 l de la solución no diluida que contiene fragmentos de micelio (si los cultivos se cultivaron en una placa de agar) en el centro de la almohadilla inanición.
2. Cerrar la cámara húmeda y envolverlo en una bolsa de plástico (esto sirve comoprotección adicional contra la desecación de las pastillas de hambre). Tenga cuidado de no mover el cuadro demasiado, porque de lo contrario se verá afectado las gotas de inoculación.
3. Almacenar la caja envuelta a temperatura ambiente durante al menos 20 h antes de analizar las muestras.

5. Análisis microscópico de las muestras

1. Después de 20 h de incubación, las muestras están listas para el análisis microscópico; puso el portaobjetos en un pañuelo de papel seco (el fondo tiende a convertirse en húmedo).
2. Pipetear un pequeño volumen de agua (aproximadamente 50 l) en la almohadilla de inanición. Ponga un cubreobjetos sobre la almohadilla y exprima el exceso de agua. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.
3. Coloque el portaobjetos de microscopio sobre la mesa de observación del microscopio de fluorescencia. Para tener una visión general de crecimiento del micelio, utilice un objetivo 20X. Uso 63X o 100X objetivos para el estudio de la localización de las buenas prácticas agrarias en las hifas. Con el fin de evitar la desecación gradual de la muestra no analizar las muestras demás de 15 minutos antes de volver a ponerlos en la cámara húmeda.
4. Repita 5,3 a intervalos regulares (por ejemplo, después de 40 horas y 60 horas de crecimiento).
   NOTA: La muestra se puede poner de nuevo en la cámara húmeda. No es necesario retirar el cubreobjetos, ya que no afecta el crecimiento del micelio.

Resultados

Para demostrar la utilidad del protocolo detallado anteriormente degradación de peroxisomas en el P. Se analizó chrysogenum cepa Ws54-1255 (GFP-SKL). En esta cepa GFP-SKL generalmente se importa en los peroxisomas ^9. Esto da lugar a la aparición de múltiples formas esféricas cuando se analiza la muestra a través de microscopía de fluorescencia. Si se produce la autofagia, las vacuolas se agrandan. GFP-SKL se incorpora en vacuolas por autofagia (pexophagy). Debido al hecho de que la GF...

Discusión

El método aquí presentado permite el estudio conveniente y reproducible de la autofagia en P. chrysogenum. Por ejemplo, puede ser utilizado para el cribado de la eficacia de diversos compuestos si son capaces de modular la respuesta autofagia de este hongo o no. Los resultados con rapamicina demuestran que la inhibición de la señalización de TOR conduce a una inducción pronunciada de la autofagia en P. chrysogenum que también ha sido demostrado para otros organismos ^11.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 - 0.50 mm