Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

Riepilogo

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Abstract

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introduzione

Funghi filamentosi sono ottimi sistemi modello per lo studio dei processi di sviluppo. Essi offrono diversi vantaggi sperimentali come la coltivazione a basso costo, un numero elevato di progenie e accessibilità genetica. L'ultimo punto è di particolare rilevanza per la costruzione di trasformanti che permettono di indagare l'importanza dei geni so-far non caratterizzate per diversi meccanismi cellulari. Funghi filamentosi sono stati strumentali per la delucidazione di diversi elementi e meccanismi di controllo della qualità vie cellulari come attività della proteasi per la degradazione delle proteine ​​aberranti, dinamiche mitocondriali per mantenere l'integrità mitocondriale e autophagy per la rimozione di eccedenza e / o componenti cellulari disfunzionali e per mantenere vitalità cellulare in tempi di fame ^1,2,3.

Ci sono diverse tecniche sperimentali disponibili per lo studio dell'autofagia in filamentose funghi ^2: (i) ricerca di vacuoli if contengono organismi autofagiche densi quando proteasi sono inibiti mediante microscopia elettronica a trasmissione ^4, (ii) visualizzazione di autophagosomes monitorando GFP-Atg8 foci tramite microscopia a fluorescenza ^5,6 e (iii) il rilevamento di strutture autophagosomal acidificati utilizzando il colorante fluorescente monodansyl cadaverina ^7.

Qui, un nuovo metodo di coltivazione Penicillium chrysogenum per studi autofagia è presentato. L'elemento principale è il 'pad fame' che consiste semplicemente di 1% agarosio disciolto in acqua di rubinetto sterilizzata. Composti aggiuntive (ad esempio, stress, spazzini, modulatori autofagia) possono essere aggiunti al pad fino a quando non visualizzano auto-fluorescenza. Il pad si trova in vetrini contenenti una cavità centrale superficiale. Questo pad in inoculati sia con una sospensione di spore o con piccoli frammenti di micelio. Quest'ultimo è consigliabile se il ceppo di interesse non sporulate in modo efficiente (ad esempio, i ceppi atg1 Δ ^8). I vetrini sono posizionati in camere umide (questi possono essere facilmente costruiti utilizzando scatole di tip pipetta vuote) per prevenire l'essiccamento del campione e incubate a temperatura ambiente. P. chrysogenum è in grado di crescere per alcuni giorni in queste condizioni. L'autofagia può essere osservato al microscopio dall'allargamento vacuolar che è un indicatore positivo per autofagia fungine. In questo contributo, una P. chrysogenum ceppo (Wisconsin 54-1255) viene utilizzato, che costituisce la proteina fluorescente verde, che si rivolge a perossisomi per la sua sequenza di ⁹ C-terminale 'SKL'. Pertanto è possibile monitorare la degradazione dei perossisomi. E 'fattibile etichettare anche altri compartimenti della cellula (ad esempio, mitocondri) utilizzando segnali di localizzazione appropriati ed analizzare la loro degradazione. Anche se i dati di P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) è presentato qui, è certamente possibileper utilizzare il metodo 'pad fame' anche per altri funghi filamentosi (es Neurospora crassa, Sordaria macrospora, specie di Aspergillus, etc.).

Protocollo

1. Preparazione di P. chrysogenum per gli esperimenti da fame

1. Se la P. chrysogenum ceppo di interessi è tenuto il riso ('riso verde'), posizionare 2-3 chicchi di riso ricoperti di sporulanti micelio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Riempire con 500 microlitri YGG (10 g / l KCl, 20 g / l di glucosio, 10 g / l di lievito base di azoto, 5 g / l K ₂ HPO ₄ estratto di lievito, 20 g / l).
   1. Agitare la provetta per 30 sec in modo che le spore possano staccarsi dal riso efficiente.
   2. Incubare la provetta per 1 giorno a temperatura ambiente (per esempio, tra 20 e 25 ° C).
   3. Preparare una diluizione 1/50 di questa sospensione di spore in acqua di rubinetto sterile, mescolare bene.
2. Se la P. chrysogenum ceppo di interesse è mantenuto su una piastra di agar (ad esempio, piastra di agar YGG), trasferire piccoli pezzi di micelio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 400 ml di acqua di rubinetto sterile e circa 100 mg glperline culo utilizzando uno stuzzicadenti sterile o punta della pipetta.
   1. Vortex la provetta per 2 minuti in modo che il micelio diventa frammentata. Utilizzare immediatamente il contenuto della provetta.

2. Operazioni preliminari per la frutticoltura di P. chrysogenum su Pads Starvation

1. Accendere una piastra di riscaldamento e impostarla a circa 60 ° C.
2. Sciogliere 2 g di agarosio in 100 ml acqua di rubinetto con la cottura la soluzione in un forno a microonde. Fate attenzione che questa soluzione è del tutto chiaro dopo il riscaldamento. Se non lo è, cuocere di nuovo fino a quando l'agarosio è sciolto completamente. Sia la soluzione di agarosio raffreddare a circa 60 ° C prima dell'uso.
3. Riempire 1,5 ml provette da microcentrifuga (2-4, a seconda del numero di campioni) con 400 microlitri di acqua di rubinetto (non sterile ciascuno composti addizionali aggiunti) o 400-x microlitri (aggiunta di x ml di soluzione del composto nella fase 2.5) e collocarli sulla piastra di riscaldamento per almeno 1 minuto in modo che il Water all'interno si riscalda.
4. Inserire vetrini contenenti una cavità centrale sulla piastra di riscaldamento per almeno 1 min.
5. Aggiungere 400 microlitri 2% agarosio alla soluzione in 1,5 ml provette da microcentrifuga e vortice brevemente. Dopo questo passo se lo si desidera, aggiungere ulteriori composti (ad esempio, 1 micron rapamicina). Se questo è fatto, vortex brevemente dopo ogni sostanza aggiuntiva è pipettato al tubo. Mettere i tubi di nuovo sul tavolo di riscaldamento per evitare la solidificazione prematura.
   NOTA: Il volume totale della provetta deve essere di 800 ml.

3. Preparazione di micropreparati contenenti Pads Starvation

1. Pipettare 140 ml di soluzione di agarosio nella cavità del vetrino da microscopio (che si trova ancora sulla piastra di riscaldamento). Cercate di evitare di fare le bolle, se possibile.
2. Mettere immediatamente un vetrino sul soluzione di agarosio.
   NOTA: Questo si tradurrà in una superficie piana.
3. Mettere il microportata vetrino sul banco di laboratorio per circa 4 minuti per consentire al pad agarosio solidificare.
4. Rimuovere con attenzione il vetrino dal pad agarosio sfilandolo con l'aiuto di un pollice o indice (indossare guanti per evitare la contaminazione!).
5. Posizionare il vetrino con il pad in una camera bagnato per evitare l'essiccamento. Raccomandazione: utilizzare una scatola vuota punta che ha ancora l'inserto per tenere le punte delle pipette. Aggiungere acqua sterile alla casella in modo che il fondo è coperto. Collocare i vetrini sull'inserto e chiudere la finestra.

4. inoculo dei pad da fame con P. chrysogenum e incubazione

1. Pipettare 5 ml di diluizione 1/50 spore (se le colture sono state coltivate su riso) o 5 ml della soluzione diluita contenente frammenti micelio (se le colture sono state coltivate su una piastra di agar) sul centro del pad inedia.
2. Chiudere la camera umida e avvolgerlo in una busta di plastica (questo serve comeprotezione aggiuntiva contro essiccazione dei tamponi fame). Fare attenzione a non spostare la casella di troppo perché altrimenti saranno disturbati le gocce di inoculazione.
3. Conservare la scatola avvolta a temperatura ambiente per almeno 20 ore prima di analizzare i campioni.

5. microscopica analisi dei campioni

1. Dopo 20 ore di incubazione i campioni sono pronti per l'analisi al microscopio; mettere il vetrino su carta velina asciutta (fondo tende a diventare bagnato).
2. Pipettare una piccola quantità di acqua (circa 50 ml) sul pad fame. Mettere un coprioggetto sul pad e spremere l'acqua in eccesso. Rimuovere l'acqua in eccesso con un fazzolettino di carta.
3. Mettere il vetrino sul tavolo di osservazione del microscopio a fluorescenza. Per avere una panoramica di crescita micelio, utilizzare un obiettivo 20X. Obiettivi Utilizzare 63x o 100X per studiare la localizzazione di GFP in ife. Al fine di prevenire il graduale essiccamento del campione non analizzare i campioni perpiù di 15 minuti prima di rimetterli nella camera umida.
4. Ripetere 5.3 a intervalli regolari (ad esempio, dopo 40 ore e 60 ore di crescita).
   NOTA: Il campione può essere rimesso nella camera umida. Non è necessario rimuovere il coprioggetto quanto non influenza la crescita del micelio.

Risultati

Per dimostrare l'utilità del protocollo sopra descritto degrado perossisoma nel P. chrysogenum ceppo Ws54-1255 (GFP-SKL) è stato analizzato. In questo ceppo GFP-SKL è di solito importato in perossisomi ^9. Ciò provoca la comparsa di molteplici forme sferiche quando il campione viene analizzato tramite microscopia a fluorescenza. Se si verifica l'autofagia, vacuoli ingrandire. GFP-SKL viene incorporato nel vacuoli da autofagia (pexophagy). A causa del fatto che la GFP è resistente alla deg...

Discussione

Il metodo qui presentato permette lo studio comoda e riproducibile dell'autofagia in P. chrysogenum. Ad esempio, può essere utilizzata per lo screening l'efficacia di vari composti che siano in grado di modulare la risposta autofagia di questo fungo o meno. I risultati con rapamicina dimostrano che l'inibizione di segnalazione TOR conduce ad una induzione pronunciato dell'autofagia in P. chrysogenum che è stato dimostrato anche per altri organismi ^11.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 - 0.50 mm