Анализ аутофагии в<em&gt; Пеницилл золотистый</em&gt; С помощью голодания колодки в сочетании с флуоресцентной микроскопии

Резюме

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Аннотация

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Введение

Нитчатых грибов являются Отличная модель системы для изучения процессов развития. Они предлагают несколько экспериментальных преимущества, как дешевый выращивания, высокой численности потомства и генетического доступности. Последний пункт имеет особое значение для строительства трансформантов, что позволяет исследовать важность так далеко охарактеризованных генов для различных клеточных механизмов. Мицелиальных грибов играют важную роль для выяснения нескольких элементов и механизмов клеточных путей контроля качества, как активность протеазы для деградации аберрантных белков, митохондриальная динамики для поддержания митохондриальной целостности и аутофагии для удаления излишков и / или компонентов неблагополучных клеток и для поддержания Жизнеспособность клеток во время голодания ^1,2,3.

Есть несколько экспериментальных методов, доступных для изучения аутофагии в нитчатых грибов ^2: (I) Исследование вакуолей яF они содержат плотные тела, когда аутофагической протеазы ингибирует помощью просвечивающей электронной микроскопии ^4, (II) визуализация аутофагосом по мониторингу GFP-Atg8 очаги с помощью флуоресцентной микроскопии ^5,6 и (III) обнаружения подкисленных autophagosomal структур с помощью монодансил кадаверин флуоресцентный краситель ^7.

Здесь новый метод выращивания Пеницилл золотистый для аутофагии исследований представлены. Основным элементом является "голодание колодок ', который просто состоит из 1% агарозы, растворенного в стерилизованной водопроводной воды. Дополнительные соединения (например, стресс-факторы, поглотители, автофагии модуляторы) могут быть добавлены к площадке, пока они не показывают автоматического флуоресценции. Накладка находится в микроскопических слайдов, которые содержат неполную центральную полость. Это колодок в инокулировали либо суспензией спор или небольших фрагментов мицелия. Последнее целесообразно, если штамм не в интересах sporulatе эффективно (например, штаммы ГПТ1 Δ ^8). Слайды расположены во влажных камерах (они могут быть легко сконструированы с использованием пипетки пустые коробки), чтобы предотвратить высыхание образца и инкубировали при комнатной температуре. П. chrysogenum может расти в течение нескольких дней в этих условиях. Аутофагия можно наблюдать микроскопически вакуолярной расширения, которая положительно маркер для грибковой аутофагии. В данной статье, в P. chrysogenum Штамм (Висконсин 54-1255) используется, который формирует зеленый флуоресцентный белок, который предназначен для пероксисом его С-концевого "СКЛ" последовательности ^9. Поэтому можно контролировать деградацию пероксисом. Вполне возможно, для обозначения и другие отсеки клетки (например, митохондрий), используя соответствующие сигналы локализации и проанализировать их деградации. Хотя, по данным P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) представлена ​​здесь, это, конечно, возможноиспользовать метод «голод Pad 'и для других нитчатых грибов (например, Нейроспора густая, Sordaria macrospora, виды Aspergillus, и т.д.).

протокол

1. Подготовка P. chrysogenum для голодания экспериментов

1. Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на рисе ("зеленая рисовая '), поместить 2-3 рисовые зерна, покрытые спорообразующих мицелий в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Заполните его 500 мкл YGG (10 г / л KCl, 20 г / л глюкозы, 10 г / л дрожжевого азотистого основания, 5 г / л K ₂ HPO _4, 20 г / л дрожжевого экстракта).
   1. Vortex трубку в течение 30 сек, так что споры могут отделиться от риса эффективно.
   2. Инкубируйте пробирку в течение 1 дня при комнатной температуре (например, от 20 до 25 ° C).
   3. Подготовьте разведение этой суспензии спор в стерильной водопроводной воде 1/50, хорошо перемешать.
2. Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на агаровой пластине (например, YGG агаром), передавать небольшие кусочки мицелия в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 400 мкл стерильной водопроводной воды и примерно 100 мг GLпопа шарики с помощью стерильного выбор зуба или пипетки.
   1. Вихревые трубки в течение 2 мин, так что мицелий становится фрагментированной. Сразу же использовать содержимое пробирки.

2. Подготовительные шаги для выращивания Р. chrysogenum на голодном колодки

1. Включите нагревательную плиту и установите его приблизительно на 60 ° C.
2. Растворить 2 г агарозы в 100 мл водопроводной воды при приготовлении раствора в микроволновой печи. Позаботьтесь, что это решение совершенно ясно после нагревания. Если это не так, готовить его снова до тех пор, пока агарозном растворяется полностью. Пусть раствор агарозы остыть до приблизительно 60 ° С до использования.
3. Заполните 1,5 мл микроцентрифужных трубки (2-4, в зависимости от количества образцов) с 400 мкл стерильной водопроводной воды каждый (никакие дополнительные соединения не добавлено) или 400-х мкл (добавление х мкл раствора соединения в стадии 2,5) и поместить их на нагревательной пластине в течение не менее 1 мин, так что Watэ внутри нагревается.
4. Поместите микроскопа, содержащие центральную полость на нагревательной пластине в течение не менее 1 мин.
5. Добавить 400 мкл 2% агарозном к раствору в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и вихревой кратко. После этой стадии, если желательно, дополнительные соединения (например, 1 мкМ рапамицина). Если это сделано, вихревые кратко после каждого дополнительного вещества с помощью пипетки в пробирку. Положите трубки обратно на стол отопления для предотвращения преждевременного затвердевания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем в микроцентрифужных трубки должны быть 800 мкл.

3. Подготовка Предметные Содержит голода колодки

1. Пипеток 140 мкл раствора агарозы в полости микроскопа (который до сих пор расположенные на нагревательной пластине). Старайтесь избегать пузыри, если это возможно.
2. Сразу место крышку скольжения на раствор агарозы.
   Примечание: Это приведет к плоской поверхности.
3. Поставьте микроСфера слайд на лабораторном столе в течение примерно 4 мин, чтобы позволить агарозном площадку затвердеть.
4. Осторожно снимите покровное из агарозы колодки, сдвинув его с помощью большого пальца или указательным пальцем (носить перчатки, чтобы избежать загрязнения!).
5. Поместите микроскопа с площадки во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание. Рекомендация: Используйте пустую коробку совет, который до сих пор имеет вставку для проведения наконечники. Добавить стерильную воду к коробке так, что дно покрыто. Поместите предметные стекла на вставку и закройте окно.

4. прививки голодание колодки с P. chrysogenum, и инкубационный

1. Пипеток 5 мкл разведении 1/50 спор (если Культуры выращивали на рисе) или 5 мкл неразбавленной раствора, содержащего мицелий фрагменты (если культуры выращивали на чашке с агаром) на центр голода площадку.
2. Закройте мокрой камеру и оберните его в полиэтиленовый пакет (это служитдополнительная защита от высыхания голодной площадки). Будьте осторожны, чтобы не переместить окно слишком много, потому что в противном случае прививка капли будет нарушен.
3. Хранить завернутые коробку при КТ в течение по меньшей мере 20 ч до анализа образцов.

5. микроскопический анализ образцов

1. После 20 ч инкубации образцы готовы для микроскопического анализа; положить стекло микроскопа на сухой папиросной бумаги (нижняя, как правило, становятся влажными).
2. Пипеткой небольшое количество воды (около 50 мкл) на голодной площадку. Положите покровное на площадке и выжать излишки воды. Удалить остатки воды с папиросную бумагу.
3. Положите стекло микроскопа на смотровой стол флуоресцентного микроскопа. Чтобы получить представление о росте мицелия, используйте цели 20X. Использование 63x или 100X цели для изучения локализации GFP в гиф. Для того чтобы предотвратить постепенное высыхание образца не анализируют образцы длябольше, чем 15 мин, прежде чем положить их обратно в мокрой камеры.
4. Повторите 5,3 через регулярные промежутки времени (например, после 40 ч и 60 ч роста).
   ПРИМЕЧАНИЕ: образец можно вернуть в мокрую камеру. Это не обязательно, чтобы удалить покровное как это не влияет на мицелия рост.

Результаты

Чтобы продемонстрировать полезность протокола описано выше деградации пероксисом в P. chrysogenum Штамм Ws54-1255 (GFP-SKL) анализировали. В этом штамме GFP-SKL, как правило, импортируются в пероксисомах ^9. Это приводит к появлению множества сферических форм, когда образец анализируют с помо?...

Обсуждение

Метод, представленный здесь позволяет удобно и воспроизводимый исследование аутофагии в Р. chrysogenum. Например, он может быть использован для скрининга эффективности различных соединений, являются ли они способны модулировать аутофагии реакцию этого гриба или нет. Результаты с рапа...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 - 0.50 mm