Analyse de l&#39;autophagie dans<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; À l&#39;aide de famine Pads en association avec microscopie de fluorescence

Résumé

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Résumé

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introduction

Les champignons filamenteux sont d'excellents systèmes modèles pour l'étude des processus de développement. Ils offrent plusieurs avantages expérimentaux comme la culture pas cher, un grand nombre de descendants et l'accessibilité génétique. Le dernier point est particulièrement important pour la construction de transformants qui permettent enquête l'importance des gènes so-far non caractérisées pour divers mécanismes cellulaires. Les champignons filamenteux ont joué un rôle pour l'élucidation de plusieurs éléments et les mécanismes de voies cellulaires de contrôle de la qualité comme l'activité de la protéase de la dégradation des protéines aberrantes, la dynamique mitochondriale pour maintenir l'intégrité mitochondriale et l'autophagie pour l'élimination de l'excédent et / ou des composants cellulaires dysfonctionnelles et pour le maintien la viabilité des cellules en temps de famine ^1,2,3.

Il existe plusieurs techniques expérimentales disponibles pour l'étude de l'autophagie dans champignons filamenteux ^2: (i) l'étude des vacuoles if ils contiennent des corps autophagiques denses lorsque proteases sont inhibées par microscopie électronique à transmission ^4, (ii) visualisation de autophagosomes en surveillant GFP-Atg8 foyers par microscopie de fluorescence ^5,6 et (iii) la détection des structures de autophagosomal acidifiés à l'aide du colorant fluorescent monodansyl cadavérine ^7.

Ici, une nouvelle méthode de Penicillium chrysogenum croissante pour les études de l'autophagie est présenté. L'élément principal est le «pad de famine», qui consiste simplement à 1% d'agarose dissous dans l'eau du robinet stérilisée. Des composés supplémentaires (par exemple, les facteurs de stress, des charognards, des modulateurs de l'autophagie) peuvent être ajoutés au pad tant qu'ils ne se affichent pas auto-fluorescence. Le tampon est situé dans des lames de microscope qui contiennent une cavité centrale peu profonde. Ce coussin en inoculé soit avec une suspension de spores ou de petits fragments de mycélium. Ce dernier est conseillé si la souche d'intérêt ne sporulate efficacement (par exemple, les souches de ATG1 Δ ^8). Les lames sont placées dans des chambres humides (ceux-ci peuvent être facilement construits en utilisant des boîtes vides pointe de pipette) pour empêcher la dessiccation de l'échantillon et on incube à la température ambiante. P. chrysogenum est capable de croître pendant quelques jours dans ces conditions. L'autophagie peut être observée au microscope par l'élargissement vacuolaire qui est un marqueur positif pour l'autophagie fongique. Dans cette contribution, un P. chrysogenum souche (Wisconsin 54-1255) est utilisé qui forme une protéine fluorescente verte qui est ciblé vers les peroxysomes par sa séquence C-terminale 'SKL ^«9. Par conséquent, il est possible de surveiller la dégradation des peroxysomes. Il est possible de marquer également d'autres compartiments de la cellule (par exemple, les mitochondries) en utilisant des signaux de localisation appropriés et pour analyser leur dégradation. Bien que les données de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) est présenté ici, il est certainement possibled'utiliser la méthode du «tapis de famine» aussi pour d'autres champignons filamenteux (par exemple, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, les espèces d'Aspergillus, etc.).

Protocole

1. Préparation de P. chrysogenum pour les expériences de famine

1. Si l'P. chrysogenum souche d'intérêt est maintenu sur le riz ('de riz vert »), placez 2-3 grains de riz recouvertes de sporulation mycélium dans un tube de 1,5 ml. Remplir avec 500 ul YGG (10 g / l de KCl, 20 g / l de glucose, 10 g / l de base azotée de levure, 5 g / l K ₂ HPO _4, 20 g / l d'extrait de levure).
   1. Vortex le tube pendant 30 secondes afin que les spores peuvent se détacher du riz efficacement.
   2. Incuber le tube pendant 1 jour à la température ambiante (par exemple entre 20 et 25 ° C).
   3. Préparer une dilution 1/50 de cette suspension de spores dans l'eau du robinet stérile, bien mélanger.
2. Si l'P. chrysogenum souche d'intérêt est maintenu sur une plaque de gélose (par exemple, YGG plaque de gélose), transférer de petits morceaux de mycélium dans un tube de 1,5 ml contenant 400 pi d'eau du robinet stérile et environ 100 mg glperles de cul en utilisant un cure-dent stérile ou pointe de la pipette.
   1. Vortex le tube pendant 2 min afin que le mycélium est fragmenté. Utilisez le contenu du tube immédiatement.

2. Les étapes préparatoires pour la culture de P. chrysogenum sur Pads de famine

1. Mettre sur une plaque chauffante et mettez-le à environ 60 ° C.
2. Dissoudre 2 g d'agarose dans 100 ml d'eau du robinet par cuisson de la solution dans un four à micro-ondes. Veillez à ce que cette solution est tout à fait clair après chauffage. Si ce ne est pas, faire cuire à nouveau jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous. Laisser la solution d'agarose à refroidir à environ 60 ° C avant utilisation.
3. Remplir tubes de 1,5 ml de microcentrifugation (4/2, en fonction du nombre d'échantillons) avec 400 pi d'eau du robinet stérile chacune (pas de composés additionnels ajoutés) ou 400-x pi (addition de x ul de solution de composé à l'étape 2.5) et placez-les sur la plaque chauffante pendant au moins 1 min de sorte que le water obtient l'intérieur chaud.
4. Placer des lames de microscope contenant une cavité centrale sur la plaque chauffante pendant au moins 1 min.
5. Ajouter 400 ul de 2% d'agarose à la solution 1,5 ml dans des tubes de microcentrifugation et brièvement vortex. Après cette étape, si désiré, ajouter des composés supplémentaires (ce est à dire, une uM rapamycine). Si cela est fait, vortex brièvement après chaque substance supplémentaire est introduit à la pipette dans le tube. Mettez les tubes de retour sur la table de chauffage pour éviter la solidification prématurée.
   NOTE: Le volume total dans le tube à centrifuger devrait être de 800 pi.

3. Préparation de microscopiques contenant Pads famine

1. Introduire à la pipette 140 ul de la solution d'agarose dans la cavité de la lame de microscope (qui se trouve encore sur la plaque chauffante). Essayez d'éviter de faire des bulles si possible.
2. Immédiatement placer une lamelle sur la solution d'agarose.
   NOTE: Cela se traduira par une surface plane.
3. Mettez le microportée glisser sur le banc de laboratoire pendant environ quatre minutes pour permettre le pad agarose se solidifier.
4. Retirez délicatement la lamelle du tampon agarose en le faisant glisser à l'aide d'un pouce ou l'index (porter des gants pour éviter la contamination!).
5. Placer la lame de microscope avec le patin dans une chambre humide pour éviter la dessiccation. Recommandation: Utilisez une boîte vide de la pointe qui a encore l'insert de maintien des embouts de pipette. Ajouter de l'eau stérile à la boîte de sorte que le fond est recouvert. Placer les lames de microscope sur l'insert et fermer la boîte.

4. inoculation les Pads famine avec P. chrysogenum et incubation

1. Introduire à la pipette 5 ul de la dilution 1/50 de spores (si les cultures ont été cultivées sur du riz) ou 5 ul de la solution non dilué contenant des fragments de mycélium (si les cultures ont été cultivées sur une plaque de gélose) sur le centre de la plaquette de famine.
2. Fermez la chambre humide et l'envelopper dans un sac en plastique (cela sertune protection supplémentaire contre la dessiccation des plots de famine). Veillez à ne pas déplacer la boîte trop car sinon les gouttes d'inoculation seront perturbées.
3. Rangez la boîte enveloppée à température ambiante pendant au moins 20 h avant d'analyser les échantillons.

5. Analyse microscopique des échantillons

1. Après 20 h d'incubation, les échantillons sont prêts pour analyse microscopique; mis la lame de microscope sur papier de tissu sec (le fond tend à devenir humide).
2. Introduire à la pipette un petit volume d'eau (environ 50 pi) sur le bloc de la famine. Mettez une lamelle sur le tampon et presser le surplus d'eau. Retirer le surplus d'eau avec un mouchoir en papier.
3. Mettre la lame de microscope sur la table d'observation du microscope à fluorescence. Pour obtenir un aperçu de la croissance du mycélium, utilisez un objectif 20X. Utilisez 63X ou 100X objectifs pour étudier la localisation de la GFP dans les hyphes. Afin d'éviter la dessiccation graduelle de l'échantillon ne ont pas analyser les échantillons pourplus de 15 min avant de les remettre dans la chambre humide.
4. Répétez 5,3 à intervalles réguliers (par exemple, après 40 h et 60 h de la croissance).
   NOTE: L'échantillon peut être remis dans la chambre humide. Il ne est pas nécessaire d'enlever la lamelle couvre-objet en tant que cela ne affecte pas la croissance du mycélium.

Résultats

Pour démontrer l'utilité du protocole détaillé ci-dessus dégradation des peroxysomes dans le P. chrysogenum souche Ws54-1255 (GFP-SKL) a été analysée. Dans cette souche GFP-SKL est généralement importé dans les peroxysomes ^neuf. Cela se traduit par l'apparition de multiples formes sphériques quand l'échantillon est analysé par microscopie à fluorescence. Si l'autophagie se produit, vacuoles agrandir. GFP-SKL est incorporé dans des vacuoles par autophagie (pexophagy). E...

Discussion

La méthode présentée ici permet l'étude pratique et reproductible de l'autophagie dans P. chrysogenum. Par exemple, il peut être utilisé pour le criblage de l'efficacité des différents composés se ils sont capables de moduler la réponse de l'autophagie de ce champignon ou non. Les résultats démontrent que la rapamycine avec inhibition de la signalisation TOR conduit à une induction marquée de l'autophagie dans P. chrysogenum qui a également été démontré pour d'...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 - 0.50 mm