Análise de Autophagy em<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por a inanição Pads em combinação com microscopia de fluorescência

Resumo

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Resumo

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introdução

Os fungos filamentosos são excelentes sistemas de modelo para o estudo dos processos de desenvolvimento. Eles oferecem vários benefícios experimentais como cultivo barato, um elevado número de descendentes e acessibilidade genética. O último ponto é de particular relevância para a construção de transformantes que permite que se investigue a importância de genes tão longe descaracterizados para vários mecanismos celulares. Os fungos filamentosos têm sido fundamentais para a elucidação de vários elementos e mecanismos de controlo de qualidade das vias celulares, como a actividade de protease para a degradação de proteínas anormais, dinâmica mitocondrial para manter a integridade mitocondrial e autofagia para a remoção de excesso e / ou componentes celulares e para a manutenção disfuncionais viabilidade celular em tempos de fome ^1,2,3.

Existem várias técnicas experimentais disponíveis para o estudo da autofagia em fungos filamentosos ^2: (i) a investigação das vacúolos if eles contêm corpos autophagic densos quando as proteases são inibidas por microscopia electrónica de transmissão ^4, (ii) a visualização de autofagossomas por monitorização focos GFP-Atg8 através de microscopia de fluorescência de ^5,6 e (iii) detecção de estruturas autophagosomal acidificadas utilizando o corante fluorescente monodansyl cadaverina ^7.

Aqui, um novo método para o crescimento de Penicillium chrysogenum para estudos autofagia é apresentado. O elemento principal é o 'pad fome ", que consiste simplesmente de agarose a 1% dissolvido em água de torneira esterilizada. Compostos adicionais (por exemplo, factores de stress, sequestrantes, moduladores autofagia) pode ser adicionado à almofada, enquanto eles não exibem auto-fluorescência. A almofada está localizada em lâminas de microscópio que contêm uma cavidade central raso. Esta almofada em inoculados com uma suspensão de esporos ou com fragmentos de micélio pequenos. O último é aconselhável se a estirpe de interesse não sporulate eficiente (por exemplo, estirpes atg1 Δ ^8). As lâminas estão posicionadas em câmaras húmidas (estes podem ser facilmente construídas usando caixas de ponta de pipeta vazios) para evitar a secagem da amostra e incubou-se à temperatura ambiente. P. chrysogenum é capaz de crescer durante alguns dias sob estas condições. Autophagy pode ser observada microscopicamente por alargamento vacuolar que é um marcador positivo para autofagia fúngica. Nesta contribuição, a P. chrysogenum estirpe (Wisconsin 54-1255) é usado, que forma a proteína verde fluorescente que é direcionado para peroxisomes pela sua sequência C-terminal 'SKL ^«9. Por conseguinte, é possível monitorizar a degradação dos peroxissomas. É possível rotular também outros compartimentos da célula (por exemplo, mitocôndrias) usando os sinais de localização adequados e analisar a sua degradação. Embora os dados de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) é apresentado aqui, é certamente possívelpara usar o método de 'almofada de fome ", também para outros fungos filamentosos (por exemplo, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, espécies de Aspergillus, etc.).

Protocolo

1. Preparação de P. chrysogenum para os experimentos de fome

1. Se o P. chrysogenum estirpe de juros é mantida em arroz ('arroz verde "), coloque 2-3 grãos de arroz cobertos com esporulação micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Preenchê-lo com 500 ul YGG (10 g / l de KCl, 20 g / l de glucose, 10 g / l de base azotada de levedura, 5 g / l de K ₂ HPO _4, 20 g / l de extracto de levedura).
   1. Vortex o tubo durante 30 segundos de modo a que os esporos podem separar de forma eficiente o arroz.
   2. Incubar o tubo durante 1 dia a temperatura ambiente (por exemplo, entre 20 e 25 ° C).
   3. Preparar uma diluição dessa suspensão de esporos na água da torneira estéril 1/50, misture bem.
2. Se o P. chrysogenum estirpe de interesse é mantida numa placa de agar (por exemplo, YGG placa de agar), transferir pequenos pedaços de micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 400 ul de água de torneira esterilizada e cerca de 100 mg glgrânulos burro usando um palito estéril ou ponteira.
   1. Vortex o tubo durante 2 minutos de modo que se torna o micélio fragmentado. Utilizar o conteúdo do tubo imediatamente.

2. Passos preparatórios para o cultivo de P. chrysogenum em Pads de fome

1. Ligue a placa de aquecimento e configurá-lo para cerca de 60 ° C.
2. Dissolve-se 2 g de agarose em 100 ml de água da torneira por cozimento a solução num forno de microondas. Tome cuidado para que esta solução é completamente claro após o aquecimento. Se não for, cozinhá-lo novamente até que a agarose é dissolvido completamente. Deixar a solução arrefecer de agarose a cerca de 60 ° C antes da utilização.
3. Encher tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (2-4, dependendo o número de amostras) com 400 ul de água estéril (sem toque em cada um adicionados compostos adicionais) ou 400 ul-x (x adição de uL de solução do composto no passo 2.5) e colocá-los sobre a placa de aquecimento durante pelo menos 1 minuto, de modo que o water dentro fica quente.
4. Colocar as lâminas de microscópio que contêm uma cavidade central sobre a placa de aquecimento durante pelo menos 1 min.
5. Adicionar 400 ul de 2% de agarose para a solução nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e vortex brevemente. Após este passo, se desejado, adicionar compostos adicionais (ou seja, 1 uM de rapamicina). Se isso for feito, vortex brevemente depois de cada substância adicional é pipetado para o tubo. Colocar os tubos de volta para a mesa de aquecimento para evitar a solidificação prematura.
   NOTA: O volume total no tubo de microcentrífuga deverá ser de 800 uL.

3. Preparação de microscópicas Contendo Inanição Pads

1. Pipetar 140 uL da solução de agarose para dentro da cavidade da lâmina de microscópio (ainda que está localizado na placa de aquecimento). Tente evitar fazer bolhas, se possível.
2. Imediatamente coloque uma lamela para a solução de agarose.
   NOTA: Este vai resultar em uma superfície plana.
3. Coloque o microâmbito deslizante na bancada do laboratório para aproximadamente 4 min para permitir a almofada de agarose para solidificar.
4. Remova cuidadosamente a lamela do pad agarose, deslizando-a com a ajuda de um polegar ou o dedo indicador (usar luvas para evitar a contaminação!).
5. Coloque a lâmina de microscópio com a almofada em uma câmara úmida para evitar a dessecação. Recomendação: Use uma caixa de ponta vazia que ainda tem o insert para manter as pontas de pipeta. Adicionar água estéril para a caixa de modo que o fundo é coberta. Coloque as lâminas de microscópio para a inserção e fechar a caixa.

4. inoculação da inanição Pads com P. chrysogenum e incubação

1. Pipetar 5 ul de uma diluição 1/50 de esporos (se as culturas foram cultivadas em arroz) ou 5 ul da solução não diluída contendo fragmentos de micélio (se as culturas foram cultivadas numa placa de agar) para o centro da almofada de inanição.
2. Feche a câmara úmida e envolvê-la em um saco plástico (isso serve comoproteção adicional contra a dessecação das almofadas de fome). Tenha cuidado para não mover a caixa muito, porque de outra forma as gotas de inoculação será perturbado.
3. Armazenar a caixa embrulhada à temperatura ambiente durante pelo menos 20 h, antes de analisar as amostras.

5. microscópica análise das amostras

1. Após 20 horas de incubação, as amostras estão prontas para análise microscópica; colocar a lâmina de microscópio em papel tecido seco (o fundo tende a ficar molhado).
2. Pipetar um pequeno volume de água (cerca de 50 mL) para a almofada de inanição. Coloque uma lamela sobre o bloco e esprema a água excedente. Retire o excesso de água com um lenço de papel.
3. Colocar a lâmina do microscópio sobre a mesa de observação de um microscópio de fluorescência. Para obter uma visão geral de crescimento micelial, use um objetivo 20X. Uso objectivos 63x ou 100x para estudar a localização de GFP nas hifas. A fim de evitar a dessecação progressiva da amostra não analisar as amostras durantemais de 15 min antes de colocá-los de volta para a câmara úmida.
4. Repita 5,3 em intervalos regulares (por exemplo, depois de 40 horas e 60 horas de crescimento).
   NOTA: A amostra pode ser colocado de volta na câmara úmida. Não é necessário retirar as lamelas uma vez que não afecta o crescimento do micélio.

Resultados

Para demonstrar a utilidade do protocolo detalhado acima degradação de peroxissoma no P. chrysogenum estirpe Ws54-1255 (GFP-SKL) foi analisada. Nesta estirpe GFP-SKL é geralmente importada para peroxisomes ^9. Isto resulta no aparecimento de múltiplas formas esféricas quando a amostra é analisada através de microscopia de fluorescência. Se ocorrer a autofagia, vacúolos ampliar. GFP-SKL é incorporado vacúolos por autofagia (pexophagy). Devido ao facto de que a GFP é resistente à degradaç?...

Discussão

O método aqui apresentado permite o estudo conveniente e reprodutível de autofagia em P. chrysogenum. Por exemplo, ele pode ser usado para o rastreio de a eficácia de vários compostos se eles são capazes de modular a resposta autofagia deste fungo ou não. Os resultados obtidos com rapamicina demonstram que a inibição da sinalização de TOR conduz a uma indução de autofagia pronunciada em P. chrysogenum que foi também demonstrada para outros organismos ^11.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 - 0.50 mm